Identificación Api Coryne Identificación genotípica IDENTIFICACIÓN ERRÓNEA DE Burkholderia contaminans COMO Burkholderia cenocepacia. IMPORTANCIA DE LA ELECCIÓN DE LOS MÉTODOS MOLECULARES PARA LA IDENTIFICACIÓN. M Prieto, L Cipolla, L Aguerre, MF Rocca, C Martínez, R Callejo INEI-ANLIS Dr Carlos G. Malbrán, Argentina. INTRODUCCION El complejo Burkholderia cepacia (BCC) esta compuesto por 17 especies que están muy relacionadas fenotípica y genéticamente: Burkholderia cepacia, B. multivorans, B. cenocepacia, B. stabilis, B. vietnamiensis, B. dolosa, B. ambifaria, B. anthina, B. pyrrocinia, B. ubonensis, B. latens, B. diffusa, B. arboris, B. seminalis, B. metallica, B. contaminans y B. lata. BCC es un grupo muy versátil de microorganismos que son utilizados con fines de bioremediación, biocontrol y como promotores de crecimiento en plantas, pero su capacidad como patógeno oportunista, en particular en pacientes fibroquisticos (FQ), han dificultado su utilización en aplicaciones biotecnológicas. Aunque todas las especies de este complejo son capaces de causar infección en humanos, la literatura mundial revela que B. cenocepacia y B. multivorans son las especies prevalentes a nivel mundial y son responsables de la mayoría de los episodios de diseminación epidémica en pacientes FQ. La epidemiología de la infección por BCC en la comunidad FQ en nuestro país aún no ha sido descrita, sin embargo, han sido informados algunos estudios recientes donde se sugiere que en la Argentina existiría una epidemiología particular, con alta prevalencia de B. contaminans . La caracterización fenotípica es limitada para la identificación de especies de BCC y existen numerosas técnicas moleculares disponibles para el rápido diagnóstico de aquellas especies de importancia clínica, la mayoría basadas en el gen recA. OBJETIVO Informar la identificación de Burkholderia contaminans en tres aislamientos de esputo de pacientes con fibrosis quística (FQ) que fueron identificados erróneamente como B. cenocepacia utilizando PCR basada en gen rec A MATERIALES Y METODOS Los aislamientos se identificaron en forma preliminar como BCC por pruebas fenotípicas convencionales utilizando marcadores fenotípicos como: oxidasa, hemólisis, producción de pigmento, sensibilidad al colistin, lisina decarboxilasa y el sistema comercial API NE (BioMerieux). La caracterización genotípica se realizó por PCR del gen recA con cebadores específicos para BCC y confirmación con cebadores específicos para las especies más frecuentes según descripto por Mahenthiralingam et al. Debido a ciertas atipias fenotípicas detectadas, se realizó la secuenciación parcial del gen 16S ARNr utilizando los primeros correspondientes a la posición 8-27 y 1492 del gen 16S ARNr de Escherichia coli, y la secuenciación total del recA utilizando los cebadores BCR 1, BCR2, BCR3 y BCR4 correspondientes a la posicion 2-20, 513-530, 528-511 y 1044-1024 del gen recA de BCC, respectivamente. Los productos de PCR fueron secuenciados utilizando el equipo Big Dye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit (Applied Biosystems) y analizados en el ABI 377 Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems). El alineamiento de las secuencias se realizó con el programa BLAST, comparándolas con secuencias disponibles en la base de datos del servicio del Nacional Center for Biotecnology Information y se utilizó el siguiente algoritmo como criterio para la interpretación de las alineaciones:   Similitud > 99%: identificación nivel especie (con divergencias mayores de 0.8% con respecto a otras especies) Similitud > 97%: identificación nivel género RESULTADOS Los perfil fenotípicos obtenidos se muestran en la tabla 1. Los tres aislamientos mostraron amplificación con los cebadores específicos para B. cenocepacia linaje IIIA. Sin embargo, debido a la presencia de beta hemolisis y la producción de un pigmento amarillo verdoso, características no descriptas para B. cenocepacia, se decidió la secuenciación parcial del gen 16S ARNr y la secuenciación del gen rec A, siendo ésta última la metodología recomendada para la identificación de referencia de este complejo. La alineación de las secuencias correspondientes al gen 16S ARNr presento similitud > 99% con varias especies: B.cenocepacia, B. cepacia, B. contaminans, B. multivorans . La secuenciación del gen rec A y posterior comparación con las secuencias depositadas en bases de datos internacionales, demostró una similitud de 99-100% con la cepa tipo de B. contaminans y divergencias mayores del 0.8% con especies relacionadas. No se observaron diferencias en la calidad de la secuencia ni en los resultados de la alineación entre los cebadores BCR1, BCR2, BCR3 y BCR4. Sin embargo se recomienda la utilización de BCR3 y BCR4 como cebadores para la secuenciación ya que la zona del gen amplificada es altamente polimórfica. Tabla 1: perfil fenotípico obtenido de tres aislamientos de esputos de pacientes FQ Perfil API Coryne (Biocódigo) Nº de Aislamientos Identificación Api Coryne Identificación genotípica 16SrARN (Nº de aislamientos) Taxón Id (%) 2100304 2 C. jeikeium 94 C. jeikeium (1) C. amycolatum (1) 2000004 1 C. Propinquum 68 C. kropentesdtii (1) 5000004 Corynebacterium sp. (1) 1100004 C. propinquum 90 0000004 Eubacterium lentum 92 CONCLUSIONES B. cenocepacia se asocia con una mayor tasa de transmisibilidad entre pacientes FQ, con un mal pronóstico, de ahí la importancia de una identificación precisa. Los tres aislamientos presentaron amplificación con cebadores específicos para B. cenocepacia linaje III A (estos resultados ya han sido informados en la literatura como falsos positivos) y esto condujo a su identificación errónea. B. contaminans es una especie descripta en 2009 por Vanlaere et al. Representa algunos aislamientos que habían sido comprendidos en el denominado taxón K, entidad taxonómica que agrupaba aislamientos de BCC no clasificados y que hasta la fecha comprende dos especies: B. contaminans y B. lata. Algunos casos de transmisión epidémica de cepas pertenecientes al taxón K fueron informados en el mundo, sin embargo, el rol de estas nuevas especies en el pronóstico y evolución clínica pre y post transplante en pacientes FQ aun no ha sido esclarecida. Además, la epidemiología de esta nueva especie en la población fibroquistica es desconocida en nuestro país pero existe evidencia preliminar que sugiere que podría tener una prevalencia particular en la región (Miñán et al)  Si bien, se recomienda a los centros de salud la incorporación de técnicas moleculares rápidas basadas en PCR para el diagnóstico preliminar de aislamientos de BCC, nuestros resultados confirman la importancia de la confirmación en laboratorios de referencia, para entender la real epidemiología de BCC en la comunidad FQ en nuestro país y así poner en práctica las medidas preventivas de control y evitar la propagación de la infección entre los pacientes con FQ en los centros de salud. Bibliografia: Mahenthiralingam et al. (2000) DNA-Based Diagnostic Approaches for Identification of Burkholderia cepacia Complex, Burkholderia vietnamiensis, Burkholderia multivorans, Burkholderia stabilis, and Burkholderia cepacia Genomovars I and III. J Clin Microbiol, 38:3165–3173 Miñán et al (2009) Rapid identification of Burkholderia cepacia complex species including strains of the novel Taxon K, recovered from cystic fibrosis patients by intact cell MALDI-ToF mass spectrometry. Analyst, 134, 1138-1148 Vanlaere et al (2009) Taxon K, a complex within the Burkholderia cepacia complex, comprises at least two novel species, Burkholderia contaminans sp. nov. and Burkholderia lata sp. nov. Int J Syst Evol Microbiol 2009; 59: 102-11.