Visió general del disseny d’experiments Llicenciatura de Biologia Disseny d’Experiments i Anàlisi de Dades Jordi Ocaña Rebull

Visió general del disseny d’experiments Contingut Estudis de camp i estudis experimentals Planificació d’estudis en Biologia Principis de disseny estadístic Dissenys més habituals en l’experimentació biològica Determinació de la grandària mostral Visió general del disseny d’experiments

Estudis de camp i estudis experimentals Proveu de comparar aquests dos estudis: Agafem sengles mostres aleatòries, la primera de fumadors passius habituals i la segona de persones que normalment estan lliures de fum de tabac. Posteriorment, mesurem el nivell de CO2 en sang de cada un d’aquests individus. Dividim a l’atzar una mostra uniforme de voluntaris no fumadors passius (ni actius) en dos grups. Seguidament el primer grup passa una temporada en un ambient ric en fum de tabac i l’altre no. Posteriorment, mesurem el nivell de CO2 en sang de cada un d’aquests individus. Visió general del disseny d’experiments

Estudis de camp i estudis experimentals 1er cas: estudi de camp, 2on cas estudi exp. Des del punt de vista del disseny d’experiments i l’anàlisi estadística: major control al segon cas, al qual: Podem assignar veritables “tractaments” d’acord a determinat criteri (aleatòriament) Diferències d’interpretació: més fàcil parlar de causalitat, anàlisi estadística la mateixa Visió general del disseny d’experiments

Planificació d’estudis en Biologia Fases principals Definició dels objectius Consideració de dissenys experimentals alternatius i tria del més adequat Determinació de les mides mostrals Recordeu la taula d’errors tipus I i II Generació d’un pla d’aleatorització Redacció del protocol experimental … experimentació i anàlisi de resultats Visió general del disseny d’experiments

Visió general del disseny d’experiments Planificació d’estudis en Biologia Caràcter iteratiu d’un estudi experimental Visió general del disseny d’experiments

Principis de disseny estadístic Les “peces” que formen un disseny “Grups experimentals”: Població de destí Població experimental Mostra El pas de cada un d’aquests nivells al seu superior implica un problema d’inferència diferent Visió general del disseny d’experiments

Principis de disseny estadístic Les “peces” que formen un disseny Inferència no estadística Representativitat: mostra aleatòria Inferència estadística Validesa del disseny: assignació aleatòria de tractaments Visió general del disseny d’experiments

Principis de disseny estadístic Les “peces” que formen un disseny Unitat experimental: més petita unitat a la qual podem aplicar els diversos tractaments Variable de resposta: variable aleatòria a mesurar a partir dels experiments Factor: variable qualitativa que representa un dels tractaments o condicions experimentals que volem estudiar (o que poden influir en la resposta) Nivells: els possibles valors d’un factor Variable covariant o concomitant: variable quantitativa de la qual pot dependre la resposta En parlar d’unitats experimentals, repassar els conceptes de Població (experimental i de destí) i mostra. Visió general del disseny d’experiments

Principis de disseny estadístic Concepte de biaix i de variabilitat biaix: desviació sistemàtica de les mesures respecte del veritable valor ( mesures acurades: no tenen biaix -o en tenen poc) variabilitat: fluctuació aleatòria al voltant d’un valor central ( mesures precises: baixa variabilitat) … és “pitjor” el biaix que la variabilitat Visió general del disseny d’experiments

Principis de disseny estadístic Fonts de biaix i de variabilitat Identificació i quantificació Revisió acurada del procés de mostratge: població de destí i població experimental, representativitat de la mostra, … Revisió del procés experimental i dels criteris de mesura. El problema dels avaluadors conveniència de dissenys “cecs” Proves d’uniformitat: estudis sense tractaments però tot reproduint les altres condicions Visió general del disseny d’experiments

Visió general del disseny d’experiments Principis de disseny estadístic Mètodes de control del biaix i la variabilitat Un factor del qual “sospitem”: Pot no ser controlable ni mesurable  Aleatorització: assignació aleatòria d’unitats experimentals a condicions experimentals (tractaments) Pot ser controlable, es pot fer participar del disseny experimental  Blocs: comparació entre tractaments solament dins grups homogenis respecte de condicions que es sospita que poden influir Pot ser mesurable, juntament amb la variable de resposta  Fer-lo intervenir a l’anàlisi estadística Visió general del disseny d’experiments

Visió general del disseny d’experiments Principis de disseny estadístic Mètodes de control del biaix i la variabilitat “Encegament”: els “agents” (pacient, metge, estadístic, ...) que intervenen a l’experiment desconeixen el tractament aplicat a cada unitat experimental Simple cec: p.e. pacient desconeix tractament rebut Doble cec: ni metge, ni pacient coneixen tractament Triple cec: ni metge, ni pacient, ni estadístic Necessitat d’un “controlador”: dipositari d’informació “encegada” (també per raons de seguretat) Visió general del disseny d’experiments

Dissenys més habituals en l’experimentació biològica Principals dissenys: Dissenys totalment aleatoritzats Dissenys estratificats/blocs aleatoritzats Dissenys creuats (crossover) Dissenys jeràrquics (mal anomenats “niats”) Dissenys split plot Dissenys de mesures repetides Altres qüestions: grups control, selecció dels nivells d’un factor, estudis multicentre, ... Visió general del disseny d’experiments

Dissenys més habituals Dissenys totalment aleatoritzats Cada unitat experimental s’assigna, a l’atzar, a exactament una condició experimental o tractament Com a conseqüència, el “factor” individu està niat dins cada grup de tractament Diversos noms segons el nombre de factors: disseny d’un sol factor: “una via” (one-way layout) disseny factorial (dos o més factors) (two-way, …) moltes condicions experimentals replicació oculta (hidden replication) Visió general del disseny d’experiments

Dissenys més habituals Dissenys totalment aleatoritzats Avantatges Simplicitat Optimització del temps de durada de l’experiment Mínim perill de pèrdua de casos Inconvenients Creixement multiplicatiu del nombre de condicions Comparació entre subjectes, no dins dels subjectes Mobilització de molts recursos en poc temps Visió general del disseny d’experiments

Dissenys més habituals Dissenys estratificats/blocs aleatoritzats Primer definim blocs o estrats (col·leccions d’unitats experimentals similars) Els “factors de bloc” sovint no interessen per ells mateixos Els diversos tractaments s’apliquen dins cada bloc El procediment d’aleatorització s’aplica per separat dins cada bloc Visió general del disseny d’experiments

Dissenys més habituals Dissenys estratificats/blocs aleatoritzats Avantatges Més control experimental Si bloc = individu, les comparacions són dins dels individus Com a conseqüència, menors mides mostrals Inconvenients Més condicions experimentals Dependència de les respostes dins cada bloc Visió general del disseny d’experiments

Dissenys més habituals Dissenys creuats (crossover) Cas especial de blocs aleatoritzats: els propis individus són blocs tots els tractaments s’apliquen a cada individu, de forma seqüencial en el temps totes les possibles seqüències de tractaments balancejades (totes amb el mateix nombre de casos) i individus assignats a l’atzar a cada seqüència període de “neteja” entre tractaments En estudis de bioequivalència, la llargada del període de neteja és, normalment, cinc vegades (com a mínim) la vida mitjana de la droga estudiada. Vida mitjana: la fase d’eliminació de la corba de concentració en sang vs. el temps en un estudi de bioequivalència es modelitza, normalment, mitjançant un corba exponencial. Així, si representem el logaritme de la concentració vs. el temps, la gràfica serà, aproximadament, lineal. L’interval de temps necessari a fi que la concentració disminueixi en un mig s’anomena la vida mitjana de la droga. Visió general del disseny d’experiments

Dissenys més habituals Dissenys creuats (crossover) Exemple: suposem que tenim tres tractaments A, B i C. Ens caldran 3 períodes de temps i tindrem 3!=6 seqüències de possibles tractaments. Si tenim 30 individus assignarem a l’atzar 5 individus a cada seqüència. Aquí aleatoritzem els individus assignant-los a seqüències. Cada tractament haurà estat observat en 30 individus. Compareu-lo amb un disseny totalment aleatoritzat: per fer que cada tractament hagi estat observat en 30 individus ens caldrien 3x30=90 individus. Visió general del disseny d’experiments

Dissenys més habituals Dissenys creuats (crossover) Avantatges Comparacions dins els individus Menors grandàries mostrals necessàries Menys recursos utilitzats simultàniament Inconvenients Poden resultar de més llarga durada Major perill de dades faltants (abandons) Perill de biaix a causa d’efectes acumulats o interaccions entre tractaments Visió general del disseny d’experiments

Dissenys més habituals Dissenys niats o jeràrquics Reflecteixen la natura jeràrquica de molts sistemes biològics (i no biològics), formats per subsistemes a diversos nivells Mostratge a diversos nivells, com ara: Individus Lòbuls del fetge (dret i esquerre) Petits lòbuls Cèl·lules (hepatòcits) Cal distingir factors fixos i aleatoris Visió general del disseny d’experiments

Dissenys més habituals Dissenys split plot S’assignen camps, finques, ... (“plots”) a l’atzar als nivells d’un factor “primari” S’assignen a l’atzar àrees menors (“subplots”) dins de cada camp als nivells d’un factor “secundari” Possibles nivells inferiors de divisió (“sub-subplots”) si són àrees molt grans Provenen i són molt utilitzats en recerca agrícola. És un exemple de submostratge. La idea subjacent és que els camps són tant grans i complexos que les comparacions entre camps no són necessàriament gaire precises o no tenen gaire sentit mentre que dins d’un camp les àrees són més comparables i adients per a comparar els nivells del factor secundari. Visió general del disseny d’experiments

Dissenys més habituals Dissenys split plot Factor primari: “adob” amb tres nivells (sac groc, sac verd-oliva, sac fúcsia). Factor secundari: “tipus de rec: G=gota a gota, A=aspersió. Visió general del disseny d’experiments

Dissenys més habituals Dissenys en mesures repetides A partir d’un cert nivell (“individu”, “plot”) el factor niat és el temps, tenim observacions per aquell “individu” en diversos instants consecutius (això no és aleatoritzable!) En lloc d’instants de temps podríem tenir, per exemple, diverses concentracions, dosis, etc. (no aleatoritzades) Visió general del disseny d’experiments

Dissenys més habituals Dissenys en mesures repetides Dos tractaments (groc, verd oliva) assignats a l’atzar Visió general del disseny d’experiments

Dissenys més habituals Dissenys niats Avantatges Permeten estudiar la variabilitat associada a cada nivell jeràrquic Factor secundari estudiat amb més precisió que el primari (en disseny split plot) Inconvenients Anàlisi més complexa que, per exemple, en un disseny totalment aleatoritzat Factor primari estudiat amb menys precisió que el secundari (en split plot) Anàlisi més complexa, per exemple, a causa de correlacions entre les mesures repetides dins d’un mateix individu Visió general del disseny d’experiments

Altres qüestions Grups o tractaments control Condició de referència (en algun sentit) Històric: dades prèvies Concurrent: obtingut al mateix estudi Control negatiu: manca de tractament real Propi subjecte abans del tractament No tractat Placebo: substància inòqua que sembla tractament Control actiu: autèntic tractament habitual –vs. nous tractaments estudiats habitual –vs. habitual + nous tractaments estudiats (càncer) Visió general del disseny d’experiments

Visió general del disseny d’experiments Altres qüestions Selecció dels nivells d’un factor, depèn de: objectius de l’estudi determinar existència d’un efecte: sovint millor 2 i prou determinar la dinàmica d’efecte dinàmica subjacent (lineal, quadràtica, sigmoidea...) Estudis multicentre Menys durada Dificultats de coordinació: cal protocol clar Sovint cal fer correspondre blocs a centres, ... Visió general del disseny d’experiments

Determinació de la grandària mostral Sovint prevalen criteris econòmics Enfoc estadístic, dues famílies de mètodes: Grandària fixa, determinada abans d’iniciar l’estudi, a partir de cert criteri d’optimalitat Seqüencial: repetidament, una nova dada (o un grup de dades) seguida d’una anàlisi que: és concloent i condueix a una decisió estadística final (i parem el mostratge) o bé a la necessitat d’obtenir una nova dada. Visió general del disseny d’experiments

Visió general del disseny d’experiments Determinació de la g. mostral Disseny al qual aplicaríem la t de Student Situació: disseny totalment aleatoritzat, estudi d’un factor amb solament dos nivells. (p.e. Volem comparar dos tractaments respecte de certa variable fisiològica, assignem a l’atzar individus a cada tractament, posteriorment farem una prova t de comparació de mitjanes.) Quants individus hem d’assignar a cada grup? Visió general del disseny d’experiments

Visió general del disseny d’experiments Determinació de la g. mostral Disseny al qual aplicaríem la t de Student Suposem per un moment que és veritat que les mitjanes són diferents (H1 és certa). En aquest cas la decisió correcta és rebutjar H0. Si no ho fem s’ha produït un error de tipus II. La probabilitat que es produeixi aquest error depèn de les grandàries mostrals, de la veritable diferència de mitjanes, de ,... Visió general del disseny d’experiments

Visió general del disseny d’experiments Determinació de la g. mostral Corba característica d’operació del test t Una corba per cada n*=2n-1 (suposem n1=n2=n) Ordenades: probabilitat d’error de tipus II Abscisses: valor d amb: Visió general del disseny d’experiments

Visió general del disseny d’experiments Determinació de la g. mostral Utilització de la corba característica d’op. Decidim el valor  a partir del qual “val la pena” detectar diferències amb “seguretat” p.e. suposem que és  =0.5 a l’exemple Decidim què vol dir “seguretat” p.e. suposem que és 5% de prob. d’error II Com que  és desconegut, procurem proposar-ne un valor (p.e. estimació) p.e. de prova pilot prèvia Visió general del disseny d’experiments

Visió general del disseny d’experiments Determinació de la g. mostral Utilització de la corba característica d’op. Tot això ens porta a Si observem les corbes c.o., n*=16 permet un 5% de prob. d’error de tipus II, Per tant 16=2n-1  n=9: caldria assignar 9 individus a cada grup experimental (tractament). Visió general del disseny d’experiments