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CITOMETRIA DE FLUJO Inmunologia – Curso 2008. Citometría de Flujo SISTEMA FLUÍDICO COMPONENTES DEL EQUIPO SISTEMA ÓPTICO SISTEMA ELECTRÓNICO.

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1 CITOMETRIA DE FLUJO Inmunologia – Curso 2008

2 Citometría de Flujo SISTEMA FLUÍDICO COMPONENTES DEL EQUIPO SISTEMA ÓPTICO SISTEMA ELECTRÓNICO

3 Citometría de Flujo

4 PARÁMETROS CELULARES MEDIDOS El tamaño celular relativo ( Forward Scatter o FSC) La complejidad interna o granularidad relativa (Side Scatter o SSC) Intensidades relativas de emisión de fluorescencia ( FL1, FL2, FL3,FL4…..etc..) Citometría de Flujo

5 FORWARD SCATER – LUZ DIFRACTADA - SE RELACIONA CON LA SUPERFICIE Y AREA CELULARES -SE DETECTA EN EL EJE DE INCIDENCIA DEL LASER SIDE SCATER – LUZ REFLEJADA Y REFRACTADA -SE RELACIONA CON LA COMPLEJIDAD INTERNA DE LA CELULA Y SU GRANULARIDAD -SE DETECTA EN UN ANGULO DE 90 GRADOS CON EL HAZ DEL LASER Citometría de Flujo

6 MARCACION DE CELULAS CON ANTICUERPOS FLUORESCENTES Se utilizan, generalmente, inmunoglobulinas monoclonales contra antígenos de la supercicie de las celulas, marcadas con colorantes fluorescentes. Control negativo: Anticuerpo del mismo isotipo marcado con el mismo fluorocromo pero que no reconoce ninguna de las moléculas de la superficie. Control negativo: células que no fueron marcadas para determinar autofluorescencia. Control positivo: células normales, células de líneas celulares. Citometría de Flujo

7 Fluorocromos utilizados Citometría de Flujo FL1 FL2 FL3 FL4

8 ANALISIS DE DATOS Los datos colectados se pueden observar de 2 maneras: 1) Histograma Eventos medidos FLUORESCENCIA

9 Citometría de Flujo HISTOGRAMA

10 Intensidad de fluorescencia y sitios de unión Intensidad de fluorescencia FITC Número de eventos FITC Citometría de Flujo

11 Los datos colectados se pueden observar de 2 maneras: 2) Dot-plot

12 Linfocitos Monocitos Analisis de datos Granulocitos

13 CD3- CD4 en sangre totalCD3 – CD4 en gate de linfocitos Elijo un gate: Ej. linfocitos

14 Expresión de Resultados Datos porcentuales Datos absolutos : Partículas de cuantificación Datos estadísticos Citometría de Flujo

15 Separación de células usando citometría de flujo (Cell sorting) -El citómetro permite separar físicamente, poblaciones de células -Se puede realizar en condiciones de esterilidad. Citometría de Flujo

16 Determinación de citoquinas intracelulares por citometría

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18 DETERMINACION DE APOPTOSIS MEDIANTE CITOMETRIA DE FLUJO TUNEL: Determina ADN fragmentado, incorporando a los extremos de ADN 12-dUTP-FITC

19 DETERMINACION DE APOPTOSIS MEDIANTE CITOMETRIA DE FLUJO TUNEL: Determina ADN fragmentado, incorporando a los extremos de ADN 12-dUTP-FITC

20 DETERMINACION DE APOPTOSIS MEDIANTE CITOMETRIA DE FLUJO ANEXINA V

21 DETERMINACION DE APOPTOSIS MEDIANTE CITOMETRIA DE FLUJO IODURO DE PROPIDIO

22 PROLIFERACION CELULAR: CFSE - Carboxifluorescein diacetato succinimidil ester (CFSE) - Sonda fluorescente que se une a proteínas intracelulares y que se reparte por igual entre las células hijas

23 CFSE X Fluorescencia / célula X / 2 X / 4 Después del cultivo Basal

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26 Cytometric bead arrays (CBA) Tonos de un color Ac. unidos a beads, emitiendo a distintas intesidades de FL3 Varios analitos Ac conjugados con PE (emitiendo en FL2), proporcionales a la conc del analito. Multiplex ensayo por CF Citoquinas – Determinación de citoquinas secretadas por citometría

27 IL-6 IL-10 MCP-1 IFN-g TNF-a IL-12 CBA para citoquinas inflamatorias PBSCBE FL-3 FL-2 FL-3 FL-2: Da cuenta de la concentración de la citoquina. FL-3: Da cuenta de las diferentes citoquinas. Citoquinas – Determinación de citoquinas secretadas por citometría


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