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TENDENCIAS EN CITOMETRÍA DE FLUJO. 1.Cuantificación del número de moléculas por célula 2.Determinación de moléculas solubles 3.Enumeración celular 4.Nuevas.

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1 TENDENCIAS EN CITOMETRÍA DE FLUJO

2 1.Cuantificación del número de moléculas por célula 2.Determinación de moléculas solubles 3.Enumeración celular 4.Nuevas formas de marcaje 4.1 Marcaje de receptores con ligandos fluorescentes 4.2 Marcaje intracelular 4.3 Marcaje de proteínas totales

3 1) CUANTIFICACIÓN DEL NÚMERO DE MOLÉCULAS POR CÉLULA INDIVIDUAL

4 Cuantificación del número de moléculas por célula individual Cuantificación del número medio de moléculas por célula La cantidad de antígeno que contiene cada célula se expresa en ABC (antigen binding capacity) o capacidad de unión antigénica

5 CUANTIFICACIÓN DE ABC 1.1) QUIFIKIT 1.2) RAINBOW BEADS

6 1.1) QUIFIKIT: FUNDAMENTO Micropartículas de calibración con cantidades determinadas de IgG unidas. Se emplea un segundo anticuerpo fluorescente anti-IgG. La fluorescencia por micropartícula es proporcional a la cantidad de IgG unida Se realiza una curva de calibración entre la intensidad media de fluorescencia frente a la capacidad de unión de anticuerpo (ABC)

7 PROTOCOLO DE MARCAJE

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9 QUIFIKIT

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11 REALIZACIÓN DE LA RECTA ESTÁNDAR Unión media bruta (ABC media bruta) relaciona la intensidad de fluorescencia con la capacidad de unión Se obtiene la formula de la recta que nos permitirá deducir la ABC media bruta de cada célula a partir de su intensidad de fluorescencia media

12 RECTA DE REGRESIÓN log ABC (antigenic binding capacity) 3456 log MFI (mean fluorescence intensity) voltage 453 (r 2 =0.999) voltage 463 (r 2 =0.999) voltage 473 (r 2 =1) voltage 483 (r 2 =0.999) voltage 493 (r 2 =0.999)

13 1.2) RAINBOW BEADS Micropartículas con número conocido de moléculas de fluorocromos unidos covalentemente

14 RAINBOW BEADS PatrónProblema

15 RAINBOW BEADS

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17 CÁLCULO DE LA DENSIDAD ANTIGÉNICA POR CÉLULA Asunción: el control negativo tiene cero moléculas del antígeno Problema: emite fluorescencia inespecífica Hay que tener en cuenta el número de fluorocromos por anticuerpo

18 CÁLCULO DE LA DENSIDAD ANTIGÉNICA POR CÉLULA La capacidad de unión específica (ABC específica o neta) es igual a la cantidad de moléculas antigénicas expresadas por cada célula. Experimentalmente se determina como la ABC media para el anticuerpo específico menos la ABC media del control negativo

19 DIFERENCIACIÓN DE POBLACIONES EN BASE A UNA DETERMINADA MOLÉCULA En linfocitos CD4 activados disminuye la intensidad de expresión del correceptor CD4. En linfocitos CD8 activados aumenta la expresión del correceptor CD8 Activación TCR modulación de CD3 La apoptosis reduce la expresión de determinados antígenos de linaje

20 2) CUANTIFICACIÓN DE CONCENTRACIONES DE MOLÉCULAS SOLUBLES

21 FUNDAMENTO El numero medio de moléculas de citocina capturadas por cada partícula se relaciona con la concentración de la citocina en el sobrenadante

22 PROTOCOLO Incubación Lavado Marcaje Lavado

23 DETERMINACIÓN DE CITOCINAS SOLUBLES Citocina SSC

24 CUANTIFICACIÓN DE CONCENTRACIONES DE MOLÉCULAS SOLUBLES Más rápido y sensible que el ELISA. 90 min. Sensibilidad fentomolar: M Multiparamétrico

25 3) ENUMERACIÓN CELULAR

26 ENUMERACIÓN CELULAR - Los métodos anteriores proporcionaban una cifra relativa de las células que están proliferando - Este método ratiométrico permite calcular el número absoluto de células con respecto a las que sembramos inicialmente

27 CULTIVOS CELULARES Medio PHA Células

28 Tras cultivo Basal R2 R1 R1 R2 R1 R2 CÉLULAS T CÉLULAS B MICROPARTÍCULAS MICROPARTÍCULAS Muertecelular Crecimiento ENUMERACIÓN CELULAR

29 Tras Cultivo Apoptosis Crecimiento

30 CÁLCULO DEL NÚMERO ABSOLUTO DE CÉLULAS N 0 = concentración celular inicial N t = concentración celular a tiempo t N t = (Ratio t / Ratio 0 ) * N 0 Ratio t = (Céls t / Partículas t ) Ratio 0 = (Céls 0 / Partículas 0 ) t. Partículas = cte. N t = (Céls t / Céls 0 ) * N 0

31 ENUMERACIÓN CELULAR Células 2000 Partículas 2000 = = = 2= = 0.5 Crecimiento Apoptosis Basal 2000 = céls céls 2 x x = céls = céls 0.5 x x = céls =

32 FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ENUMERACIÓN CELULAR Centrifugación Sedimentación de células y micropartículas Número de células y de micropartículas adquiridas

33 CENTRIFUGACIÓN CELULAR Número de lavados 0123 % de recuperación celular g 200 g

34 SEDIMENTACIÓN DE CÉLULAS Y MICROPARTÍCULAS Ratio Céls/Micropartículas Adquiridasinmediatamente Tras 20 minutos: 2. Adquirir 3. Agitación manual. 4. Vortex * *

35 NÚMERO DE CÉLULAS Y MICROPARTÍCULAS ADQUIRIDAS Ratio células/partículas CV del ratio

36 VALIDACIÓN DEL MÉTODO Precisión –Coeficiente de variación (CV) Sensibilidad –Límite de sensibilidad Exactitud –Linealidad

37 ESTUDIO DE LA PRECISIÓN Y DE LA SENSIBILIDAD Contadorescelulares Células/ml x CV (%) Microscopía Citometría de flujo

38 ESTUDIO DE LA EXACTITUD Contadorescelulares Microscopía Citometría De flujo

39 ENUMERACIÓN DE CÉLULAS APOPTÓTICAS Las células apoptóticas se fragmentan en cuerpos apoptóticos Las células apoptóticas pierden la expresión de antígenos específicos de linaje.

40 FRAGMENTACIÓN CELULAR Una célula apoptótica se fragmenta en varios cuerpos apoptóticos. ¿Cuál es el límite en FSC entre las células apoptóticas y los cuerpos apoptóticos?

41 FRAGMENTACIÓN CELULAR Aunque se pudiera precisar el límite, perdemos células ya fragmentadas que escapan del gate de análisis. Permeabilidad de membrana Tamaño celular

42 INCIDENCIA DE LA APOPTOSIS Prevalencia = apoptóticas /viables+apoptóticas = (1/5) 20% = prevalencia de la apoptosis Incidencia = (apoptóticas + fragmentadas+ pérdidaAg) / total = (6/10) 60% = incidencia de la apoptosis

43 INCIDENCIA DE LA APOPTOSIS (1/10) = 10 % prevalencia Incidencia = (1/10) 10%

44 APOPTOSIS TEMPRANA (4/9) = 44% prevalencia Incidencia (5/10) = 50%

45 (1/5) = 20 % prevalencia Cuerpos apoptóticos Fragmentación celular Incidencia = 60% APOPTOSIS TARDÍA

46 IMPACTO DE LA FRAGMENTACIÓN CELULAR EN LA MEDIDA DE LA APOPTOSIS 0 hours 24 hours 6 hours

47 PÉRDIDA DE ANTÍGENOS ESPECÍFICOS DE LINAJE (AEL) Si las células apoptóticas pierden su AEL, la prevalencia de la apoptosis en la población positiva será menor que su incidencia en la población original

48 APOPTOSIS INDUCIDA POR CICLOHEXIMIDA

49 MFI 061 MFI 004 MFI 015Célulasviables Apotóticastempranas Apoptóticastardías Apoptóticasintermedias CD19 on B-CLL leukemic cells MFI 131 Estudio de la expresión de AEL en células en diferentes estadios de la apoptosis

50 Viable cells Early Apoptotic Intermediate Apoptotic Late Apoptotic MFI ESTADIO DE LA APOPTOSIS PÉRDIDA DE LA INTENSIDAD MEDIA DE FLUORESCENCIA DE ANTÍGENO ESPECÍFICO DE LINAJE (CD19) POR CÉLULA INDIVIDUAL

51 PÉRDIDA DE LA INTENSIDAD MEDIA DE FLUORESCENCIA DE ANTÍGENO ESPECÍFICO DE LINAJE (CD8 Y CD56) POR CÉLULA INDIVIDUAL

52 PÉRDIDA DE LA INTENSIDAD MEDIA DE FLUORESCENCIA DE ANTÍGENO ESPECÍFICO DE LINAJE (CD3 Y CD5) POR CÉLULA INDIVIDUAL

53 PORCENTAJE DE PÉRDIDA DE AEL ENTRE LAS CÉLULAS VIABLES Y LAS APOPTÓTICAS TEMPRANAS (EA)

54 REPERCUSIÓN EN LA INCIDENCIA DE LA APOPTOSIS DE LA FRAGMENTACIÓN CELULAR Y DE LA PÉRDIDA ANTIGÉNICA APOPTÓTICAS + NEGATIVAS + FRAGMENTADAS ___________________________________________________________ VIABLES + APOPTÓTICAS + NEGATIVAS + FRAGMENTADAS AI APOPTÓTICAS VIABLES + APOPTÓTICAS _________________________________ =

55 REPERCUSIÓN EN LA INCIDENCIA DE LA APOPTOSIS DE LA FRAGMENTACIÓN CELULAR Y DE LA PÉRDIDA ANTIGÉNICA APOPTÓTICAS VIABLES + APOPTÓTICAS APOPTÓTICAS + NEGATIVAS + FRAGMENTADAS VIABLES + APOPTÓTICAS + NEGATIVAS + FRAGMENTADAS = 0.25= 0.5<

56 AR vs. AI Subpoblación linfocitaria CD19CD56CD8CD4CD3 % de células apoptóticas AI AR

57 4) NUEVOS MÉTODOS DE MARCAJE

58 4.1 Marcaje de receptores con ligandos fluorescentes 4.2 Marcajes intracelulares 4.3 Marcajes de proteínas totales

59 4.1) MARCAJE DE RECEPTORES CON LIGANDOS FLUORESCENTES

60 Estudio de receptores con ligandos solubles (citocinas, factores de crecimiento). Para medir la capacidad de unión de ligando por célula individual. Se emplean ligandos marcados con moléculas fluorescentes Buffer de marcaje especiales optimas para unión del ligando a su receptor específico

61 4.1) MARCAJE DE RECEPTORES CON LIGANDOS FLUORESCENTES Ligando-FITC

62 4.1) MARCAJE DE RECEPTORES CON LIGANDOS FLUORESCENTES Ligando-FITC Ligando

63 4.1) MARCAJE DE RECEPTORES CON LIGANDOS FLUORESCENTES Ligando-FITC Dominio de unión

64 4.1) MARCAJE DE RECEPTORES CON LIGANDOS FLUORESCENTES Ligando-FITC Unión inespecífica

65 4.2) MARCAJE DE MOLÉCULAS INTRACELULARES

66 Mitocondriales (Bcl-2, Apo-2) de gránulos de secreción (citocinas, perforinas, granzimas) Detección de receptores presentes en citoplasma pero no expresados en superficie Caracterización multiparamétrica de las células que producen las citocinas en poblaciones de células mononucleares

67 4.2) MARCAJE DE MOLÉCULAS INTRACELULARES Permite el estudio de gran número de células y realizar medidas estadísticamente significativas: –10 error = 33% –100 error = 10% – error= 1% Aporta información sobre producción de citocinas por células individuales caracterizadas por inmunofenotipo

68 LIMITACIONES DE LAS TÉCNICAS DE MARCAJE INTRACELULAR Sensibilidad limitada: –cantidad mínima de citocina detectable en cada célula –frecuencia mínima de células positivas discriminable del fondo Para marcar intracelularmente hay que matar las células

69 SENSIBILIDAD

70 SOLUCIONES CANTIDAD MÍNIMA DE CITOCINA DETECTABLE EN CADA CÉLULA Anticuerpos marcados con APC para aumentar la intensidad de fluorescencia media por célula Aumentar el número de fluorocromos por anticuerpo Inhibidores del transporte celular para aumentar las concentraciones intracelulares

71 FRECUENCIA DE CÉLULAS POSITIVAS DISCRIMINABLES +S, -E-S, +E

72 AMPLIFICACIÓN ENZIMÁTICA DEL MARCAJE INTRACELULAR Se marcan las células con anticuerpos conjugados con peroxidasa de rábano (HRP) La HRP produce radicales inestables tiramina conjugados con biotina que se depositan alrededor del lugar de catálisis La adición de estreptavidina conjugada con HPR amplifica la señal Se incrementa 15 veces la relación señal-ruido

73 AMPLIFICACIÓN CATALÍTICA DEL MARCAJE INTRACELULAR (CARD) Sustrato Radical tiramina Tiramina + Biotina HPR

74 AMPLIFICACIÓN CATALÍTICA DEL MARCAJE INTRACELULAR (CARD) Estreptavidina-HPR +

75 EXPRESIÓN EN MEMBRANA DE CITOCINAS IL-10 e IFN se expresan en membrana plasmática en un número bajo de copias (<300 copias/membrana) Sistemas de amplificación –Liposomas magneto-fluorescentes 1 x 10 5 IL IFN

76 EXPRESIÓN EN MEMBRANA DE CITOCINAS IL IFN

77 EXPRESIÓN EN MEMBRANA DE CITOCINAS IL IFN

78 MARCAJE EXTRACELULAR CON ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS Uso de anticuerpos biespecificos anti- CD45-anti-citocina para la captura de las citocinas producidas por células individuales Se pueden fabricar también con fragmentos F ab

79 MARCAJE EXTRACELULAR CON ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CD45Anti-citocinaCitocina

80 MARCAJE EXTRACELULAR CON ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS Permite la separación de las células viables productoras de una citocina determinada por FACS o por separación inmunomagnética Estas células se pueden analizar por otros métodos o cultivarse para obtener clones

81 4.3) MARCAJE DE PROTEÍNAS TOTALES

82 RELACIÓN ENTRE LA PROLIFERACIÓN CELULAR Y LA APOPTOSIS Proliferación Todas se dividen una vez 1 cél. apoptosis 1 se divide 3 veces ½ apoptosis ½ se dividen 2 veces

83 HISTORIAL DE DIVISIONES: CFSE - Carboxifluorescein diacetato succinimidil ester (CFSE) - Sonda fluorescente que se une a proteínas intracelulares y que se reparte por igual entre las células hijas

84 HISTORIAL DE DIVISIONES: CFSE

85 CFSE X Fluorescencia / célula X / 2 X / 4

86 Después del cultivo Basal MARCAJE CON CFSE

87 CULTIVOS CELULARES Medio PHA Células

88 HISTORIAL DE DIVISIONES: CFSE No proliferantes Proliferantes

89 HISTORIAL DE DIVISIONES: CFSE

90 HISTORIAL DE DIVISIONES: CFSE Combinación con antígenos de superficie: relación procesos de diferenciación con procesos de proliferación

91 PHA + IL-2 3% 59% 38% 3%53% 44% 3 días de cultivo

92 PHA + IL-2 23%48% 29% 15%48% 37% 5 días de cultivo

93 PHA + IL-2 71%19% 10% 37%40% 23% 7 días de cultivo

94 MARCAJE CON CFSE Estudios in vivo Estudios ex vivo Estudios in vitro


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