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Microscopía y técnicas de estudio a nivel celular.

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Presentación del tema: "Microscopía y técnicas de estudio a nivel celular."— Transcripción de la presentación:

1 Microscopía y técnicas de estudio a nivel celular

2 Tipos de microscopios Ópticos Electrónicos Campo claro Campo Oscuro Contraste de fase Confocal Fluorescencia Transmisión Barrido Microscopía

3 Algunos Conceptos… Resolución (D)Magnificación Aumento que logra el equipo Distancia mínima a la cual el equipo puede mostrar dos puntos como entidades separadas

4 ¿De qué depende la resolución? 0,5. λ Algunos Conceptos… n. senθ D = ¿Cómo disminuir D?

5 ¿De qué depende la resolución? 0,5. Algunos Conceptos… n. senθ D = Longitud de onda del haz de luz λ FILTRO AZUL

6 ¿De qué depende la resolución? Algunos Conceptos… 0,5. n. D = λ senθ Objetivo muestra LENTE CON AN MAYOR

7 ¿De qué depende la resolución? Algunos Conceptos… Índice de refracción Es el cambio de dirección que experimenta un rayo de luz cuando pasa de un medio transparente a otro también transparente. Este cambio de dirección está originado por la distinta velocidad de la luz en cada medio. n Aire : 1 n Aceite :1,5 0,5. n D = λ. senθ ACEITE DE INMERSIÓN

8 Microscopio óptico EL PORTAOBJETOS REVOLVER TORNILLOS DE

9 Microscopio óptico

10 Microscopio óptico - Campo claro Eosinofilia

11 Microscopio óptico - Campo oscuro Observar organismos vivos sin necesidad de tinción Objetos brillantes sobre un fondo oscuro

12 Microscopio óptico - Campo oscuro Treponema pallidum

13 Aumenta pequeñas diferencias en el índice de refracción y densidad en la célula Microscopio óptico - Contraste de fase Observar organismos vivos sin necesidad de tinción El anillo forma un cono hueco de luz. El rayo de luz que atraviese la muestra va a retrasarse respecto del rayo que siga de largo luz sombra

14 Microscopio óptico - Contraste de fase

15 Células HeLa (Henrietta Lacks) Eritrocitos Humanos Zygnema Filamentous Algae Microscopio óptico - Contraste de fase

16 Microscopio óptico - Interferencia Permite la visualización detallada sin teñir Maximiza la diferencia entre los índices de refracción entre las partes de la muestra de forma de hacer visibles los limites celulares Mismo principio que el microscopio de contraste de fase pero utiliza luz polarizada

17 Microscopio óptico - Contraste de fase e interferencia Contraste de fase Interferencia diferencial

18 Los objetos pueden también visualizarse por la luz que ellos mismos emiten Microscopio óptico - Fluorescencia Restringe infrarrojo Pasa sólo la λ que permite la excitación del fluorocromo

19 Aequoria victoria Microscopio óptico - Fluorescencia Algunos objetos fluorescentes… GFP (Green fluorescent protein)

20 hela Drpspphila Célula de cebolla (peroxisomas)

21 Microscopio óptico - Fluorescencia - Confocal

22

23

24 Microscopía electrónica - Microscopio electrónico de transmisión (TEM)

25 Bacilos en divisiónMitocondria x Herpes virus ensamblándose en el núcleo Bacteria fagocitada por un macrófago Microscopía electrónica - Microscopio electrónico de transmisión (TEM)

26 Microscopía electrónica - Microscopio electrónico de barrido (SEM)

27 Glomérulo renal 1200x Célula en corte transversal Piel humana Espermatozoides bovinos Microscopía electrónica - Microscopio electrónico de barrido (SEM)

28 Célula vegetal con cristales (falsa tinción)Bacterias sobre un estoma Glób. Rojo Glób. Blanco Microscopía electrónica - Microscopio electrónico de barrido (SEM)

29 Elevados costos de los equipos y una infraestructura adecuada no permiten el uso de la técnica en cualquier laboratorio. Altos costos de procesamiento de las muestras La manipulación de reactivos se torna peligroso por la elevada condición toxica de los mismos. Procesamiento tedioso de la muestra. Creación de artefactos La complejidad de los equipos requiere de personal técnico especializado. Proporciona resultados de amplia resolución y magnificación Microscopía electrónica - Ventajas y desventajas

30 Técnicas inmunológicas

31 ELISA Western blot Inmunohistoquímica Inmunofluorescencia Citometría de flujo Técnicas inmunológicas Introducción a las Técnicas inmunológicas

32 Técnicas inmunológicas - Inmunoglobulinas

33 Anticuerpo Antígeno Técnicas inmunológicas - Anticuerpos epitope Linfocito B Activación

34 Antígeno Técnicas inmunológicas - Anticuerpos Epitope A Epitope C Epitope B

35 Técnicas inmunológicas - Anticuerpos policlonales Antigeno Activación Linfocitos B

36 Técnicas inmunológicas - Anticuerpos policlonales Suero Centrifugación Sangre Purificación

37 Técnicas inmunológicas - Anticuerpos policlonales

38 Técnicas inmunológicas - Anticuerpos monoclonales Antígeno Purificación de Linfocitos B Sangrado Cultivo de células tumorales + Fusión Hibridoma

39 Hibridomas Screening: Búsqueda de hibridoma positivo y aislamiento Purificación de anticuerpos monoclonales del sobrenadante de cultivo de los hibridomas Técnicas inmunológicas - Anticuerpos monoclonales

40 ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Para detectar Antígenos Anticuerpos

41 ELISA ELISA Para detectar Anticuerpos SensibilizaciónBloqueo Incubación con Suero

42 ELISA ELISA Para detectar Anticuerpos LavadoAnticuerpo 2ºRevelado

43 ELISA ELISA Para detectar Antígenos SensibilizaciónBloqueo Incubación con Suero

44 ELISA ELISA Para detectar Antígenos LavadoAnticuerpo 2ºRevelado

45 ELISA

46 Técnicas inmunológicas - Detección indirecta

47 Biotina Avidina Técnicas inmunológicas - Complejo avidina/biotina

48 Antígeno Ac. primario Ac. secundario Biotina Cromógeno Cromóforo Avidina Peroxidasa Técnicas inmunológicas - Detección indirecta

49 Western blot Transferencia SDS PAGE Gel Membrana

50 Western blot BloqueoAnticuerpo 1º Anticuerpo 2º biotinilado Avidina-peroxidasa Revelado Sustrato coloreado que precipita al reaccinar Sustrato que emite luz al reaccionar con la enzima

51 Inmunohistoquímica Trozo de tejido Se corta en secciones muy finas y se coloca en un portaobjetos Anticuerpo 1ºAnticuerpo 2º biotinilado Avidina-peroxidasa Revelado

52 Inmunohistoquímica - Sustratos

53 Inmunohistoquímica - Revelado Anti MMP-13 revelado con DAB Contratinción hematoxilina

54 Rodamina Fluoresceina Ficoeritrina DAPI Bromuro de Etidio Naranja de Acridina Inmunofluorescencia

55 N-myc/CD56 Rat neurons Inmunofluorescencia

56 Inmunofluorescencia - colocalización La colocalización permite determinar si dos antígenos se encuentran en el mismo lugar (nucleo, vacuola, retículo, etc) dentro de una célula

57 Inmunofluorescencia - colocalización

58 Citometría de Flujo CélulaMedida En movimiento Medida de las propiedades de las células mientras están en un flujo de líquido Inmunofenotipificación Viabilidad/apoptosis/Proliferación Ciclo celular Cambios en la superficie Actividad enzimática

59 Citometría de Flujo Mezcla de células Marcación con anticuerpos monoclonales

60 Citometría de Flujo La presión ejercida por una columna de fluido obliga a las células a enfilarse de a una

61 Citometría de Flujo Columna de células

62 Citometría de Flujo Laser Detector

63 Citometría de Flujo Tamaño Granularidad La luz que se detecta en la misma dirección del laser (forward) es detectada por el canal Forward Scatter Channel (FSC). La intensidad de la señal detectada se relaciona con el tamaño, y el indice de refracción de las células La luz que se detecta a 90 grados del haz del laser (side) es detectada por el canal Side Scatter Channel (SSC) La intensidad de la señal es proporcional a la cantidad de estructuras citosólicas en la célula (gránulos, inclusiones, etc)

64 Citometría de Flujo Dado que FSC es proporcional al tamaño y SSC a las estructuras internas, una correlación entre ellos permiten la diferenciación de los distintos tipos celulares en una población celular heterogenea FSC SSC Linfocitos Monocitos Granulocitos RBCs, debris, Células muertas

65 Citometría de Flujo - Histograma Intensidad de fluorescencia Cuentas

66 Citometría de Flujo - Dot Plot FL1 FL2

67 Citometría de Flujo - Dot Plot

68 Citometría de Flujo - Cell sorting

69 Citometría de Flujo

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