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FUNDAMENTOS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO. Relevancia Estudio directo de las patologías mediante esta tecnología: Estudio directo de las patologías mediante.

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Presentación del tema: "FUNDAMENTOS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO. Relevancia Estudio directo de las patologías mediante esta tecnología: Estudio directo de las patologías mediante."— Transcripción de la presentación:

1 FUNDAMENTOS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO

2 Relevancia Estudio directo de las patologías mediante esta tecnología: Estudio directo de las patologías mediante esta tecnología: Conocimiento y búsqueda de información de carácter diagnóstico y pronóstico Conocimiento y búsqueda de información de carácter diagnóstico y pronóstico

3 ¿Qué es la citometría de flujo ? FSC 90º 2- 4º Columna de muestra Meeting point Láser Detectores de luz AmplificacióndigitalizaciónRepresentación y Analisis y Analisis Flujo

4 VENTAJAS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO VENTAJAS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO - Medidas multiparamétricas (x, y, z) en grandes números de células individuales (miles). - Medidas multiparamétricas (x, y, z) en grandes números de células individuales (miles). - Aumento en la representatividad de las muestras estudiadas y en la precisión de las medidas. - Aumento en la representatividad de las muestras estudiadas y en la precisión de las medidas.

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9 Cámara de flujo FSC 90º Fluido envolvente Columna de muestra Luz dispersada lateralmente y luz fluorescente, = 90 y luz fluorescente, = 90º Luz incidente Luz dispersada hacia delante, = Luz dispersada hacia delante, =2- 4º

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13 Información Que Se Obtiene: Luz Información Que Se Obtiene: Luz - Propiedades Al Atravesar La Luz: - Propiedades Al Atravesar La Luz: - Luz Reflejada O Difractada - Luz Reflejada O Difractada Propiedades Fluorescentes: Propiedades Fluorescentes: - Fluorocromos (Fitc, Pe, Apc, Tc…) - Fluorocromos (Fitc, Pe, Apc, Tc…)

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15 Luz dispersada a 90 grados (Side SCattered light ) Detector FSC Detector de 90º SSC Laser

16 DETECCION DE LUZ DISPERSADA HACIA DELANTE (FORWARD SCATTERED LIGHT, FSC) FSC SSC El detector de FSC convierte luz dispersada hacia adelante en un pulso de voltaje proporcional al tamaño de la célula/particula

17 DETECCION DE LUZ DISPERSADA LATERALMENTE (SIDE SCATTERED LIGHT, SSC) FSC SSC El detector de SSC convierte la luz dispersada lateralmente en un pulso de voltaje proporcional a l contenido en orgánulos membranosos (granularidad)

18 Granulocitos Monocitos Linfocitos Morfología y antígenos de diferenciación en el análisis de la heterogeneidad celular

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21 Laser Detectores de fluorescencia Fluorescencia Detector Detector de fluorescencia (PMT3, PMT4 etc.)

22 Fluorescencia FSC FL-1 FL-2

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24 Fluorescencia Proceso por el que una molécula absorbe luz, aumenta su energía y vuelve al estado basal emitiendo un fotón. Parte de la energía se pierde en las transiciones entre los distintos estados por tanto el fotón emitido tiene menos energía (mayor longitud de onda) que el que fue absorbido. Parte de la energía se pierde en las transiciones entre los distintos estados por tanto el fotón emitido tiene menos energía (mayor longitud de onda) que el que fue absorbido. t ( s) E 1 < 2 1 <

25 Espectros Espectro de Absorción –Representación de la intensidad de absorción de luz de distintas las longitudes de onda por una sustancia. Espectro de Emisión –Representación de la intensidad de emisión de una sustancia excitada con luz de una determinada longitud de onda. nm excitación medida Intensidad de fluorescencia

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27 Fluoresceina (FITC) 400 nm500 nm600 nm700 nm Wavelength Proteinas Excitación Emisión 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

28 Proceso de señales 1. Separación de señales luminosas 1. Separación de señales luminosas 2. Detección de señales luminosas 2. Detección de señales luminosas 3. Amplificación de señales eléctricas 3. Amplificación de señales eléctricas 4. Corrección de errores 4. Corrección de errores –Compensación de señales – Discriminación de señales debidas a dobletes (proceso de pulsos). 6. Transformación de señales eléctricas analógicas en digitales 6. Transformación de señales eléctricas analógicas en digitales 7. Almacenamiento matricial (list mode) de la información resultante 7. Almacenamiento matricial (list mode) de la información resultante

29 PMT Filtros Dicroicos Bandpass Filtros Optica en los citómetros de flujo Laser Flujo Celular

30 Etidio PE Acido Parinárico Texas Red PE-TR Conj. PI FITC 600 nm300 nm500 nm700 nm400 nm Laseres comunes

31 DETECCIÓN DE FLUORESCENCIA TC PerCP QR Cy5 APC FL-1FL-2FL-3FL-4 Detectores Fluorocromos

32 Compensación de señales Fundamento Superposición de espectros de emisión. Parte de la señal de emitida por un fluorocromo es leída por el detector de otro color Concepto sustracción de una parte de la señal medida en un color a la señal medida en otro color FL-2 - %FL1 excitaciónmedida Intensidad de fluorescencia FL-1FL-2

33 DIGITALIZACION Y ALMACENAMIENTO DE INFORMACIÓN N FSC SSC FL FL FL FL TIEMPO Los pulsos deVoltaje(señales analógicas) son transformadas en señales digitales Las señales digitales almacenan en un soporte informático en modo listado (almacenamiento multiparamétrico). Las señales digitales almacenan en un soporte informático en modo listado (almacenamiento multiparamétrico).

34 PROCESO DE INFORMACION Histogramas Diagramas biparamétricos

35 Proceso de la información generada 1. Representación de la información 2. Selección de la información 3. Reducción de la información 4. De la célula a la población celular

36 Representación monoparamétrica de datos. Representación monoparamétrica de datos. Histogramas. Se representa en cada valor de x (intensidad de fluorescencia) el número de células que emiten esa intensidad.

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39 Histogramas SSC FSC FL-1 FL-2 FL-3

40 Representación biparamétrica en 2D Diagrama de puntos / dot plot Representación simultánea de dos parámetros X e Y para un conjunto de células. X representa el valor de la señal de un parámetro. Y representa el valor de la señal del otro FL-1 FL-2

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43 Diagrama de dot plot density Usa colores para representar densidad

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45 Estadisticas biparamétricas Cuadrantes Combinación de dos umbrales de positividad para dos parámetros Número de células % de células ULULULUL URURURUR LL LRLRLRLR

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