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Anticuerpos Anti-HLA en el trasplante renal: detección y significado Massari, Pablo Castellano, Mauro Carrera de Posgrado en Nefrología UCC Servicio de.

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1 Anticuerpos Anti-HLA en el trasplante renal: detección y significado Massari, Pablo Castellano, Mauro Carrera de Posgrado en Nefrología UCC Servicio de Nefrología y Programa de Trasplantes Renales Hospital Privado-Centro Médico de Córdoba 12 de Mayo de 2011

2 INTRODUCCION Definición Clases HLA Respuesta inmunologica

3 Complejo Mayor de histocompatibilidad (MHC): – Región heterogénea y polimorfa del brazo corto del cromosoma 6 (6p21.3). – Codifica moléculas de superficie celular (HLA). – Herencia mendeliana codominante. – Dividido en 3 regiones:

4 Clase I – HLA A, B y C. – Expresadas en casi todas las células nucleadas del organismo (Ausente en eritrocitos y trofoblastos). – Formados por una cadena pesada (α) codificada en el HLA y una cadena liviana (β) codificada en el Cr 15. – También contiene HLA-E, HLA-F y HLA-G (Moléculas MHC no Clásicas). – Unen péptidos derivados del citoplasma. – Presentan antígenos peptídicos a linfocitos T CD8+ induciendo apoptosis o liberación de citotoxinas.

5 Clase I – (Moléculas MHC no Clásicas) Limitado Polimorfismo. Baja expresión en la superficie celular. Distribución celular y tisular muy selectiva. Son reconocidas por receptores NK (RNK). HLA G : – expresado en trofoblasto fetal y células epitelio tímico. – Se une a ILT-2, ILT4, KIR2DL ( - ) lisis por NK y LT. – Inducción de tolerancia materno-fetal. – Vigilancia del sistema inmune frente a tumores. HLA E : – Se une a CD94/NKG2A que ( - ) actividad NK y de ciertos LT. HLA F : – Se expresa en amígdalas, bazo y timo. – Se unen a LIR 1 y LIR 2 e inhiben linfocitos

6 Clase II: – HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP. – Expresados constitutivamente en células B, células dendríticas y monocitos. Pueden ser expresados en otras células durante la inflamación (citoquinas: IL-2 y IFN-gamma). – Constituidas por una cadena pesada (α) y una cadena liviana (β) ambas codificadas en el MHC. – Unen péptidos derivados de proteínas extracelulares. – Presentan antígenos a Linfocitos T CD4+.

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8 Clase III – No contiene ningun gen del HLA, pero codifica genes de importancia en la respuesta inmune: Complemento (C2, C4 y factor B). Factor de Necrosis tumoral. Heat shock protein.

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11 TÉCNICAS DE DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-HLA

12 Crossmatch (XM) Busca anticuerpos anti-HLA en el suero del receptor que reaccionen con los Antígenos HLA del donante. Suero del receptor + Células del donante – XM + : Presencia de anticuerpos en el suero del receptor dirigidos contra las células del donante contraindica el trasplante. – XM - : Ausencia de anticuerpos en el suero del receptor dirigidos contra las células del donante permite el trasplante.

13 Crossmatch (XM) Objetivos: – Detectar Anticuerpos – Identificar Especificidad Métodos: – CDC (Citotoxicidad Dependiente Complemento) – ELISA – Citometría de Flujo – Luminex

14 Crossmatch (XM) Variantes: – Contra panel PRA (Panel Reactive Antibodies) pre y post trasplante. CDC, ELISA, CF, LUMINEX – Contra donante vivo (DV) pre y post trasplante. CDC-AHG en LT y LB, CF, LUMINEX – Contra donante cadavérico (DC) CDC-AHG en LT y LB, CF

15 Crossmatch contra Panel (PRA) Porcentaje de reactividad del suero del paciente frente a un panel de células (antígenos) Medida del grado de sensibilización – Pacientes bajo riesgo : PRA < 20% – Pacientes elevado riesgo : PRA > 30% – Pacientes hipersensibizados : PRA > 70% Fuerza Especificidad

16 Crossmatch contra Panel PRA por CDC. PRA por CF (screening clase I/II). PRA por Luminex (screening clase I/II).

17 Mayor Sensibilidad FlowPRA ELISA CDC Menor Sensibilidad Sensibilidad en detección de Anticuerpos anti-HLA

18 METODOS Citotoxicidad dependiente de Complemento ELISA Citometría de flujo Luminex

19 Citotoxicidad dependiente de C (CDC) Reacción antígeno-anticuerpo con fijación de complemento y visualización de la reacción con un colorante. Se pueden utilizar células (linfocitos T y/o B) aislados de sangre periférica, ganglio linfático o bazo La reacción se cuantifica según el porcentaje de células muertas. Este es el método de referencia clásico. Prueba cruzada pretrasplante positiva frente a células T contraindica el trasplante (Patel y Terasaki 1969). La significación de un resultado positivo con células B mediante la misma técnica no contraindica el trasplante en todos los casos. (Stites y cols., 1997).

20 Citotoxicidad dependiente de C (CDC) Diacetato de Fluoresceína: colorante vital capaz de atravesar la membrana intacta de las células. Bromuro de etidio: se incorpora al ADN; las membranas intactas lo excluyen.

21 Citotoxicidad dependiente de C (CDC) Reacción CDC

22 Citotoxicidad dependiente de C (CDC) Score de las reacciones de CDC % cel muertasValor asignadoInterpretación 0 – – – – 100 Unreadable Negativo Borderline negativo Positivo débil Positivo Positivo fuerte Sin cel, contaminación

23 Citotoxicidad dependiente de C (CDC) Incrementa probabilidad de unión de C *Cantidad de anticuerpos anti-HLA menor al umbral de detección por método estándar. *Anticuerpos no fijadores de C. Agregado de Inmunoglobulina Humana Mayor sensibilidad

24 Citotoxicidad dependiente de C (CDC) Limitaciones: – Determinamos presencia de anticuerpos citotóxicos (fijadores de complemento: IgM e IgG) – No permite distinguir entre la presencia de anticuerpos relevantes en el trasplante (anti-HLA) y anticuerpos no relevantes en el trasplante (por ejemplo, autoanticuerpos, generalmente IgM). – Variante de la técnica clásica: Tratar los sueros con dithiotreitol (DTT) para eliminar la IgM. Mediante este tratamiento sólo detectaríamos anticuerpos IgG presentes en el suero. Algunos anticuerpos de isotipo IgM pueden presentar especificidad anti-HLA y se han asociado en casos aislados con rechazos hiperagudos y con una menor supervivencia del injerto (Katznelson y cols., 2002; Smit y cols., 1991; Taylor y cols., 1989; Chapman y cols., 1986). – Para la determinación del grado de PRA se necesita ensayar cada suero con un panel amplio de células (alrededor de 40), por lo que este tipo de determinaciones tiene una demora considerable.

25 Aloanticuerpos: IgG Autoanticuerpos: IgM DTT: Rompe enlaces disulfuro que unen al pentámero de IgM. Suero + DTT Alo/Autoanticuerpos? POSITIVO IgG NEGATIVO IgM

26 Autoanticuerpos Pac.con LES Pac.tratados con antiarrítmicos candidatos a tx cardíaco Pac.tratados con medicación antihipertensiva PRA mayor 80% no específico y reacción fuerte Crossmatch positivo entre hnos idénticos Crossmatch positivo,c/DTT negativo Mayor reactividad al frío Mayor reactividad a los LB

27 Citotoxicidad dependiente de C (CDC) Ventajas – No se necesita utilizar equipos de difícil manejo y calibración para la interpretación de los resultados. – En la prueba cruzada pre-trasplante es la técnica de referencia.

28 Detección de anticuerpos presentes en un suero que son capaces de reconocer antígenos purificados adheridos a un soporte sólido. Revelado uso de un segundo anticuerpo marcado con un enzima y adición de un sustrato de la enzima que origina una reacción colorimétrica interpretada por espectrofotometría. ELISA

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30 Ventajas: – Determinación rápida y específica – Cubren todas las especificidades – No se requieren cel. viables – Detecta sólo IgG (se usa para screening de ac anti- HLA: IgG) – Detecta Ac contra Ag de clase I y II – Detecta Ac HLA específicos y Ac HLA que no unen complemento (IgG2,IgG4) – > sensibilidad, detecta Ac de bajo título – Se puede realizar el XM después del trat. con anti- CD3, anti-timogl, anti-CD20

31 ELISA Limitaciones de la técnica – Sólo podría utilizarse para el estudio de anticuerpos anti-HLA presentes en el suero de pacientes en lista de espera, pero no en la prueba cruzada pretrasplante. – La fuente de la que se obtengan los antígenos purificados es fundamental para la interpretaciónde resultados. – Algunas casas comerciales utilizan plaquetas para obtener los antígenos por lo que estas preparaciones a pesar de contener teóricamente sólo moléculas HLA suelen estar contaminadas con antígenos plaquetarios que pueden dar lugar a falsos positivos

32 Citometría de Flujo Reacción antígeno-anticuerpo sobre la superficie celular visualizada mediante la utilización de un segundo anticuerpo marcado con un fluorocromo y el uso de un citómetro de flujo. Técnica de análisis celular; medición de características de dispersión de luz y fluorescencia de las células. Suspensión celular. Las muestras son las mismas que para CDC, pero no es necesario separar las poblaciones T y B, ya que el uso de anticuerpos monoclonales marcados con fluorocromos nos permite distinguirlas en el citómetro. Las células deben tener también buena viabilidad Es hasta cien veces más sensibles que el método de CDC en la detección de anticuerpos en linfocitos y además no requiere fijación del complemento (Stites y cols., 1997).

33 Citometría de Flujo Superficie celular Antígeno

34 Citometría de Flujo Citómetro de Flujo: – Instrumento que detecta cada célula presente en una corriente de líquido iluminada por un haz de láser (Janeway y cols.,2003).

35 Citometría de Flujo Fundamento: Estructura Básica: Sistema Fluídrico (inyección de la muestra) Sistema Óptico (Fuentes de luz) Sistema Eléctrico (amplificador-convertidor)

36 Citometría de Flujo Parámetros celulares medidos: – El tamaño celular relativo ( Forward Scatter o FSC) – La complejidad interna o granularidad relativa (Side Scatter o SSC) – Intensidades relativas de emisión de fluorescencia ( FL1, FL2, FL3, FL4, etc.) Complejidad interna

37 Citometría de Flujo Limitaciones de la técnica – Se requiere de un aparataje sofisticado y calibración óptima del citómetro. – Determinamos es la presencia de anticuerpos pero no permite distinguir entre la presencia de anticuerpos relevantes y no relevantes en el trasplante. – Para la determinación del grado de PRA y de la especificidad de los anticuerpos presentes en el suero de los pacientes en lista de espera las limitaciones son las mismas que en el caso de la microlinfocitotoxocidad.

38 Citometría de Flujo Ventajas – Mayor sensibilidad que CDC. – En determinados grupos de pacientes (aquellos en que existe rechazo previo, los que presentan PRA elevado y riñón límite) una prueba cruzada negativa con células T utilizando la microlinfocitotoxicidad y positiva usando citometría de flujo sería predictivo de una peor supervivencia del injerto frente a un resultado de prueba cruzada mediante citometría de flujo también negativo (Martín y cols., 2003) – Permite diferenciar anticuerpos IgG de IgM

39 Luminex Método similar a la citometría convencional, utiliza microesferas recubiertas de moléculas HLA en lugar de células. El uso de la citometría de flujo permite el escrutinio de anticuerpos séricos frente a antígenos HLA con una sensibilidad mayor que el método convencional de microlinfocitotoxicidad dependiente de complemento.

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41 LABScan 100® System

42 Classification Laser Reporter Laser PMT Photo Multiplier Tube/Rep Avalanche Photo Diodes/CL

43 Luminex Limitaciones de la técnica – No puede ser utilizado en la prueba cruzada pretrasplante. – Se requiere de un aparataje sofisticado y calibración óptima del citómetro. – La fuente de la que se obtengan los antígenos purificados es fundamental para la interpretación de resultados. Elevados costes. Ventajas – Permite determinar de manera rápida la PRA y especificidad de los sueros de pacientes incluidos en lista de espera. – Teóricamente se detectan sólo anticuerpos frente a moléculas HLA. – La sensibilidad de la técnica es comparable a la de la citometría convencional.

44 SIGNIFICACIÓN CLÍNICA

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46 Revisión que intenta validar T EORÍA H UMORAL. Anticuerpos puede: – Causar rechazo renal hiperagudo in vitro. – Conducir a depósitos de C4d asociados con falla temprana del injerto renal. – Buenos marcadores de sensibilización, conduciendo a rechazo agudo prematuros – Presentes en 96% de 826 pacientes que presentaron rechazo del injerto renal. – Asociados con rechazo crónico en 33 estudios de injertos renales, cardíacos, pulmonares y hepáticos. – Aparecen en circulación ANTES del rechazo renal. Nuevas Hipótesis – Si la Teoría Humoral es aceptada, pacientes que presentan anticuerpos pueden ser tratados con inmunosupresión hasta que los anticuerpos desaparezca, para demostrara hasta donde el rechazo crónico puede ser bloqueado. – En pacientes que no presentan anticuerpos, la inmunosupresión puede ser reducida hasta que aparezcan los anticuerpos.

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51 Estudio prospectivo. 8 años de seguimiento. Objetivo: – Analizar influencia de DSA preformados identificados por ELISA en la sobrevida del injerto. – Evaluar incidencia de rechazo mediado por anticuerpos (AMR) en pacientes con y sin desensibilización pre injerto. 237 trasplantes renales ABO compatibles (221 cadavéricos y 16 donantes vivos). CDCXM cel T y B negativos. Screening retrospectivo con ELISA para DSA. Episodios de rechazo confirmados por biopsia.

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56 308 pacientes trasplantados renales. CDCXM T y B negativos. Se excluyeron 2 pacientes que estaban con terapia de desensibilización. 69 pacientes (22%) desarrollaron FCXM preoperatorio positivo. Seguimiento con FCXM trimestral. Dos grupos: – I: pacientes que negativizaron XM – II: pacientes que no negativizaron XM Igual esquema de inmunosupresión: Metilprednisolona + Tacrolimus + Micofenolato mofetil. Rechazo confirmado por biopsia según criterios Banff 97.

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62 Estudio prospectivo, unicéntrico. Diseñado ad hoc para determinar si la presencia de anticuerpos contra panel anti-HLA clase I y/o II son predictivos de pérdida de injerto debido a CAN. 512 trasplantados, 91 (17.8%) con anticuerpos anti-HLA + – 55 (10.7%) anti-HLA class II – 20 (3.9%) anti-HLA class I – 16 (3.1%) anti-HLA class I and class II

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65 Conclusiones Avances en materia de detección de anticuerpos Anti-HLA. Anticuerpos Anti-HLA son predictores de Rechazo Crónico y aparecen antes de que este se produzca. Principalmente Anticuerpos Anti-HLA II están involucrados en Falla del Injerto. Nuevas líneas de investigación para tratamiento de desensibilización y evitar progresión a Fallo de Injerto.

66 MUCHAS GRACIAS!


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