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PCR en Tiempo Real. ADN molde Primers Taq polimerasa dNTPs MgCl 2 Buffer Fluorocromo.

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Presentación del tema: "PCR en Tiempo Real. ADN molde Primers Taq polimerasa dNTPs MgCl 2 Buffer Fluorocromo."— Transcripción de la presentación:

1 PCR en Tiempo Real

2 ADN molde Primers Taq polimerasa dNTPs MgCl 2 Buffer Fluorocromo

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4 PCR convencional

5 Ventajas Sensibilidad Cuantificación Monitoreo de todo el procedimiento Disminución del riesgo de contaminación Automatización Amplicones pequeños Amplio rango dinámico Transcripción reversa

6 Sist. de Detección Colorantes de unión al ADN Oligonucleótidos específicos Sondas fluorescentes Primers fluorescentes No específico Curva de disociación Económico SYBR Green

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8 Sist. de Detección Colorantes de unión al ADN Oligonucleótidos específicos Sondas fluorescentes Primers fluorescentes No específico Curva de disociación Económico SYBR Green

9 FAM: fluoresceína JOE: dimetoxi-dicloro-fluoresceína TAMRA: tetrametil-rodamina ROX: rodamina X

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11 LUX primers

12 Sondas TaqMan®

13 Molecular Beacons ®

14 Sondas Scorpions

15 A mayor producto de amplificación mayor fluorescencia!!!!

16 Threshold Basal Control Negativo Ct ΔRn Muestra Rn Número de ciclos

17 Rn: intensidad de la señal emitida por el reporter normalizada por la emisión del colorante utilizado como referencia pasiva (ROX). Threshold: umbral en el que se produce un cambio significativo en la fluorescencia. Basal: ciclos iniciales de la PCR (3-15) en los cuales hay cambios mínimos en la emisión de fluorescencia. Ct: número de ciclo en el cual la fluorescencia emitida supera el threshold. Está inversamente correlacionado con el log. del núm. inicial de copias. ΔRn: magnitud de fluorescencia generada durante la PCR.

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23 Controles endógenos: β-Actina rARN 18S GAPDH β2-microglobulina

24 Métodos de cuantificación Cuantificación Absoluta Cuantificación Relativa a) Método del ΔΔCt: compara los Ct del gen testeado y del gen de referencia (ΔCt) en cada muestra, y luego se comparan los ΔCt de las muestras experimentales con respecto a los calibradores. (EFICIENCIA 100%). r= 2 -(ΔCtm-ΔCtc) r= 2 -(ΔΔCt)

25 b) (E target ) ΔCt target (control-muestra) r= (E endógeno ) ΔCt endógeno (control-muestra ) E= 10 [-1/ pendiente]-1

26 Curva de disociación Contenido de GC. Secuencia y tamaño del amplicón.

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28 Ej. Cuantificación Relativa (SYBR Green) mediante el método del 2 -(ΔΔCt) Objetivo : medir la expresión de TRalfa en leucocitos PMN de ratas controles e hipotiroideas. Endógeno: beta-actina. Tejido calibrador: hígado de rata.

29 Curva de Rango Dinámico TRalfa

30 Curva de Rango Dinámico Beta Actina

31 Puesta a punto: cDNA Primers (Calibrador!!!!!)

32 Target: TRalfa ( m y calibrador) Master Mix Endógeno: BetaActina( m y c) NTC!!!

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39 Ej. Discriminación Alélica (Taqman) Objetivo: determinar genotipo homocigota o heterocigota para polimorfismo en gen de PPARγ2. Alelos: Ala12 Pro12

40 Sonda 1 (FAM) Sonda 2 (VIC) Alelo 1 Match Mismatch Alelo 2 Match Mismatch

41 Homocigota alelo 1: Heterocigota: Homocigota alelo 2:

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