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Electroforesis Método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas (ácidos nucleicos,

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Presentación del tema: "Electroforesis Método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas (ácidos nucleicos,"— Transcripción de la presentación:

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2 Electroforesis Método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas (ácidos nucleicos, proteínas) según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa.

3 Técnicas Northern blot: separación de moléculas de ARN transferencia a una matriz se fija Southern blot: separación de moléculas de ADN transferencia a una matriz se fija Western blot: separación de proteínas transferencia a una matriz se adhiere anticuerpo específico se fija

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5 Procedimiento General A) Cultivo tisular B) Lisado celular y obtención de proteínas. C) Electroforesis en gel de poliacrilamida. D) Transferencia de las proteínas a un papel de nitrocelulosa. E) Incubación del papel con suero del paciente. F) Si existen anticuerpos para el Antígeno en el suero, éstos se unirán fuertemente a las proteínas transferidas al papel y se detectarán como bandas oscuras (f).

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7 Procedimiento General Los anticuerpos primarios pueden detectarse a través de dos métodos: 1) Usando proteína A o proteína G 2) Con la participación de un segundo anticuerpo

8 Tanto la proteína A como la proteína G son proteínas que se aislan de la pared celular de bacterias y que tienen la capacidad de unirse a la región Fc de los anticuerpos. Ambas pueden ser marcadas con facilidad con enzimas y otros marcadores. La proteína G tiene una capacidad de reconocimiento más amplia que la proteína A.

9 Anticuerpos secundarios: -Anticuerpos anti-anticuerpos -Anticuerpos monoclonales -Fragmentos Fab2, producidos mediante digestión con pepsina de los anticuerpos puros

10 Ensayo de transferencia Western para VIH

11 Es un enzimoinmunoensayo cualitativo para la detección in vitro de anticuerpos frente a los virus de VIH-1 y VIH-2, en suero o plasma humanos. Es más especifico para la detección de VIH en plasma o suero.

12 Se utiliza electroforesis y electrotransferencia para la adhesión de antígeno vírico del VIH-1. Péptido sintético específico contra VIH-2. Control interno para reducir el riesgo de falsos negativos.

13 Principios quimicos y biologicos Tiras de nitrocelulosa +VIH1+VIH2 Incubación en control y diluidos Si presentan anticuerpos frente VIH1 y VIH2 Se observa la union de estos a los antigenos y proteinas Lavado Reacciones con anticuerpos de cabra anti IgG humana Deteccion de cantidades ínfimas de anticuerpos.

14 Componentes del kit Tiras de nitrocelulosa Control no reactivo Control reactivo fuerte Control reactivo debil Tampón de blotting concentrado (10x) Tampon de lavado concentrado (20X) Conjugado Sustrato Polvo de blotting

15 Control de Calidad Debe cumplir con las siguientes condiciones: Control no reactivo: no bandas específicas de VIH1 u VIH2. la banda control debe ser visible. Control reactivo fuerte: todas las bandas de peso molecular que corresponda deben ser visibles. Control reactivo débil: medida de sensibilidad del kit. Las bandas del control de suero deben ser visibles.

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17 Interpretación de los resultados Tiras deben estar completamente secas. Se determina comparando cada tira de nitrocelulosa con las tira de control de ensayo con los controles No reactivo, Reactivo Fuerte y Reactivo Débil. Algunos antígenos derivan de las mismas proteínas precursoras y pueden tener epitopos superpuestos.

18 Verificar que la banda de control del suero sea visible Identificacion del peso molecular de cada banda de la tira de analisis utilizando como guia las tiras de control reactivo Fuerte, Debil o ambos. Interpretacion de las tiras de analisis según las autoridades pertinentes.

19 PMENVGENAntígenoDescripción Gp 160ENVForma polimerica de la gp41 Ancha y difusa de glucoproteina Gp 120ENVMembrana externa Difusa de glucoproteina p66POLTranscriptasa inversa Banda discreta p55GAGProteina precursora Banda discreta p51POLTranscriptasa inversa Banda discreta justo por debajo de p55 p39GAGFragmento de p55Banda discreta gp41ENVTransmembranaDifusa de glucoproteina p31POLEndonucleasaDoblete p24GAGProteína central (core) Banda ancha p17GAGProteína central (core) Banda ancha

20 Todas las bandas deben ser detectadas e interpretarse como Negativo, Positivo o Dudoso. PatronInterpretacion Ninguna banda virica especifica presente Negativo Deteccion de anticuerpos p17 unicamente Negativo Deteccion de dos ENV y GAG o POLVIH-1 positivo Deteccion de dos ENV y GAG o POL y banda especifica de VIH-2 visible VIH-1 positivo con VIH-2 señalado Cualquier banda virica especifica presente, pero el patro no cumple con los patrones de positivo Dudoso Cualquier banda virica especifica presente,pero el patron no cumple los criterios para positivo con una banda especifica de IH-2 visible Dudoso con VIH-2 señalado

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