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Análisis Citométrico de la Función Plaquetaria: Técnicas de Análisis.

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Presentación del tema: "Análisis Citométrico de la Función Plaquetaria: Técnicas de Análisis."— Transcripción de la presentación:

1 Análisis Citométrico de la Función Plaquetaria: Técnicas de Análisis

2 ESTUDIO CLINICO DE LA HEMOSTASIA: INTEGRACION DE FUNCION PLAQUETARIA Y COAGULACION El estado actual del conocimiento de la hemostasia, su regulación y su patología exige incluir el análisis de la función plaquetaria en el estudio de los fenómenos prohemorrágicos y protrombóticos. El desarrollo actual de la citometría de flujo la convierte en una tecnología de elección para ese fin. La disponiblidad de técnicas citométricas en sangre entera potencia el valor diagnóstico y pronóstico de la citometría de flujo en el estudio clínico de la hemostasia.

3 LA PREGUNTA CLAVE: ¿HAY VIDA MAS ALLA DE ESTE HISTOGRAMA?

4 LA RESPUESTA: HAY VIDA (SIN NUCLEO) MAS ALLA DE ESTE HISTOGRAMA!!!

5 LAS DIEZ MEJORES EXCUSAS PARA NO ESTUDIAR LA FUNCION PLAQUETARIA POR CITOMETRIA DE FLUJO Los citómetros de flujo son para analizar leucocitos. Las plaquetas son demasiado pequeñas para ser detectadas. Las plaquetas sólo se pueden estudiar en forma de PRP. Las plaquetas se activan con mucha facilidad. No hay marcadores fenotípicos de plaquetas. Hay demasiados marcadores fenotípicos de plaquetas. Pero si en la Hemostasia lo importante es la coagulación... Pero si ya se usa un contador de plaquetas... Pero si ya se usa el agregómetro... Pero si ya las estudian en el Centro de Transfusiones...

6 ESTUDIO COMPLETO DE LA HEMOSTASIA: VENTAJAS DE LA CITOMETRIA EN SANGRE ENTERA Permite estudiar la función plaquetaria en condiciones cuasi-fisiológicas La manipulación mínima previene la activación artefactual de plaquetas Evita la pérdida potencial de subpoblaciones plaquetarias Requiere pequeños volúmenes de muestra (pocos microlitros de sangre) Permite el análisis simultáneo de plaquetas y otras células sanguíneas

7 ESTUDIO COMPLETO DE LA HEMOSTASIA: VENTAJAS DE LA CITOMETRIA EN SANGRE ENTERA P E L +ADP BASAL

8 ESTUDIO COMPLETO DE LA HEMOSTASIA: CITOMETRIA FUNCIONAL VERSUS AGREGOMETRIA ADP SS Log FS Log

9 CITOMETRIA DE FLUJO EN EL ANALISIS DE PLAQUETAS Hasta ahora, el análisis citométrico de plaquetas más habitual es el de anticuerpos antiplaquetarios: Autoanticuerpos Aloanticuerpos: Inmunofenotipo de HPA-1a Detección de anticuerpos maternos y fetales anti-HPA-1a Analisis de IgG asociadas a plaquetas en trombopenias Analisis de IgG asociadas a plaquetas en aloinmunización Cross-match de plaquetas

10 La función plaquetaria también se puede analizar ampliamente en sangre entera por citometría de flujo Activación plaquetaria in vivo Reactividad plaquetaria in vitro Interacciones plaqueta-plaqueta Interacciones plaquetas-leucocito Interacciones plaquetas-eritrocito Liberación de micropartículas procoagulantes Alteraciones en el recuento de plaquetas Alteraciones en la morfología de la plaqueta Maduración normal y patológica de la plaqueta Monitorización del tratamiento antiagregante CITOMETRIA DE FLUJO EN EL ANALISIS DE PLAQUETAS

11 ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA ANALISIS DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA

12 La preparación y el procesamiento de la muestra deben ser cuidadosos para mantener las funciones intrínsecas Las condiciones del análisis citométrico se deben adaptar para acotar la población de plaquetas ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA RBC Plaquetas

13 La extracción debe realizarse en reposo y con el mínimo traumatismo Se recomienda desechar los primeros mL de muestra La sangre entera se debe anticoagular con citrato Las muestras se diluyen (1:100) para minimizar la formación de agregados plaquetarios Se utiliza un anticuerpo monoclonal contra una proteína constitutiva de la superficie de la plaqueta para identificar y seleccionar la población plaquetaria ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA

14 Preparar todos los reactivos necesarios anticipadamente Dispensar la sangre sobre anticoagulante Diluir la sangre (antes de 30 min) con el tampón adecuado Opciones de ensayo: Fijar Marcar Activar Fijar Marcar Activar Marcar Fijar Marcar Activar Fijar Marcar y activar simultáneamente Fijar Diluir en tampón adecuado o fijador Analizar p0or citometría de flujo ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA

15 Muestras fijadas Ventajas: Fácil de realizar antes de 30 minutos de la toma de muestra Mejor estimación estática del estado de activación plaquetario Desventajas: Impide estudiar las respuestas de activación plaquetaria Algunos epitopos se pueden alterar por el fijador Muestras frescas Ventajas: Posibilidad de medir la activación plaquetaria in vivo y la reactividad plaquetaria a varios agonistas Desventajas: La preparación es crítica debido a la activación espontánea de las plaquetas con el tiempo ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA

16 En ausencia de agonistas exógenos se determina el estado de activación in vivo de las plaquetas circulantes La adición de un agonista permite analizar la reactividad in vitro de las plaquetas circulantes. +ADP BASAL ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA

17 Los agonistas más utilizados para la estimulación de plaquetas son: Agonistas fuertes: Trombina y TRAP Agonistas débiles: ADP, Colágeno, Tromboxano A2 Ionóforos de Calcio: Ionomicina, A23187 Esteres de forbol: PMA ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA

18 BASALCOLLAGEN ADPTHROMBIN ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA

19 [ Ca 2+ [ = 100 nM Plaqueta en reposo Plaqueta activada STD gránulos densos mitocondrias gránulos Ca 2+ en sangre = en citosol Ca 2+ Canales específicos GPIIb/IIIa Ca 2+ STD GD

20 La respuesta plaquetaria se puede estimar con: Anticuerpos monoclonales contra marcadores de activación Fluorocromos específicos de funciones bioquímicas Parámetros morfológicos asociados a cambios funcionales CD62P Contaje ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA

21 PARAMETROS CITOMETRICOS DE ACTIVACION PLAQUETARIA Parámetro Ca libre citosólico 2+ Actina G Cambio detectado Aumento reversible Polimerización a Actina F Marcador Citométrico FLUO-3 AM Falacidina Faloidina Cambios en FS Cambios en SS Emisión de Fluorescencia Aumento reversible ---- Aumento reversible Tamaño Granularidad Aumento o Disminución Desgranulación

22 PARAMETROS CITOMETRICOS DE ACTIVACION PLAQUETARIA Mepacrina Parámetro Cambio detectado Marcador Citométrico Emisión de Fluorescencia Gránulos densos (Número) Complejos gp IIb/IIIa (Número) Complejos gp b/V/IX (Número) Liberación del contenido Disminución en superficie Aumento en superficie Anticuerpos específicos Anticuerpos específicos Disminución Aumento

23 PARAMETROS CITOMETRICOS DE ACTIVACION PLAQUETARIA Parámetro Cambio detectado Marcador Citométrico Emisión de Fluorescencia Complejos gp IIb/IIIa Complejos gp IIb/IIIa Complejos gp IIb/IIIa Complejos gp IIb/IIIa Conformación alterada Conformación alterada Unión de ligandos Expresión de LIBS y RIBS Anticuerpos específicos Anticuerpos específicos contra ligandos Anticuerpos específicos simultáneos Anticuerpos específicos contra neoepítopos Aumento Modificación de la resonancia de fluorescencia FRET

24 PARAMETROS CITOMETRICOS DE ACTIVACION PLAQUETARIA Parámetro Cambio detectado Marcador Citométrico Emisión de Fluorescencia Fosfolípidos aniónicos Aumento Factores de la coagulación CD62P (P-Selectina) CD63 (gp53) Aumento Anticuerpos específicos Anticuerpos específicos Anticuerpos específicos contra V y VIIIa Annexina V Aumento

25 PARAMETROS CITOMETRICOS DE ACTIVACION PLAQUETARIA CD107a (LAMP-1) CD 107b (LAMP-2) Gp40 CD40L Parámetro Cambio detectado Marcador Citométrico Emisión de Fluorescencia Aumento Anticuerpos específicos Anticuerpos específicos Anticuerpos específicos Anticuerpos específicos

26 PARAMETROS CITOMETRICOS DE ACTIVACION PLAQUETARIA Detección de plaquetas activadas in vivo: Objetivos: Detección de plaquetas activadas circulantes Medición del riesgo protrombótico o prohemorrágico Aspectos metodológicos: El análisis se efectúa en sangre completa periférica Identificación de plaquetas: CD41, CD49 o CD61 con PE Cuantificación de P-selectina: CD62P-FITC Cuantificación del receptor activo de fibrinógeno: PAC-1 FITC

27 ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA Detección de plaquetas activadas ex vivo: Objetivos: Determinación de la respuesta a agonistas exógenos Estimación del riesgo protrombótico o prohemorrágico Monitorización de tratamientos antiplaquetarios Caracterización del perfil de activación plaquetaria Aspectos metodológicos: El análisis se efectúa en sangre periférica Activación con agonistas plaquetarios: ADP, trombina, etc. Identificación de plaquetas: CD41, CD49 o CD61 con PE Cuantificación de P-selectina: CD62P-FITC Cuantificación del receptor activo de fibrinógeno: PAC-1 FITC

28 ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA Análisis de la Activación ex vivo Análisis de la activación in vitro Procedimiento típico de un ensayo de activación plaquetaria

29 Anticuerpos CD41/GPIIb ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA

30 Anticuerpos contra el receptor de trombina ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA

31

32 Expresión de P-selectina (CD62P): CD62P-FITC + ADP BASAL +ADP BASAL FS log CD62P-FITC Contaje

33 ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA Inducción de la activación: Objetivos: ·Medición del riesgo protrombótico o prohemorrágico ·Monitorización de tratamientos antiplaquetarios ·Caracterización del perfil de activación plaquetaria Aspectos metodológicos: ·El análisis se efectúa en sangre periférica ·Activación con agonistas específicos ·Identificación con CD41, CD49 o CD61 con PE ·Medida cinética de la liberación de calcio con Fluo-3 o Fluo-4

34 ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA Inducción de la activación: +ADP

35 ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA Inducción de la activación:

36 ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA Medida de la expresión de superficie procoagulante: Objetivos: Cuantificación de la expresión de fosfatidilserina en la superficie de la plaqueta activada Evaluación de la contribución plaquetaria a la coagulación Aspectos metodológicos: El análisis se efectúa en sangre periférica Identificación con CD41 o CD61 con PE o PC5 Medida de fosfatidilserina con Anexina V-FITC

37 ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA Medida de la expresión de superficie procoagulante:

38 ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA Análisis cuantitativo de micropartículas plaquetarias: Objetivos: Detección y cuantificación de fragmentos circulantes de membrana plaquetaria que expresan fosfatidilserina Diferenciar micropartículas activadas y no activadas Evaluación de la contribución plaquetaria a la coagulación Aspectos metodológicos: El análisis se efectúa en sangre periférica Identificación con CD41 o CD61 con PE o PC5 Medida de fosfatidilserina con Annexina V-FITC Método normalizado en Biocytex

39 BASAL ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA

40 A M ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA

41 A M ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA BASAL

42 ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA Análisis cuantitativo de micropartículas plaquetarias: Number of Pathological Samples : n = 22 Test A Test B CD61/CD41 Annexin V/CD41 Mean SD Range Results expressed in number of events / µl whole blood Micropartículas activadas Micropartículas plaquetarias

43 A BC D E F G RBC Plaquetas ADP Basal ADP A23187 Basal ADP Basal EJEMPLO DE ANALISIS CITOMETRICO INTEGRADO DE LA FUNCION PLAQUETARIA


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