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MICROSCOPíA Y TÉCNICAS DE ESTUDIO CELULAR. Tipos de microscopios Ópticos Electrónicos Campo claro Campo Oscuro Contraste de fase Confocal Fluorescencia.

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1 MICROSCOPíA Y TÉCNICAS DE ESTUDIO CELULAR

2 Tipos de microscopios Ópticos Electrónicos Campo claro Campo Oscuro Contraste de fase Confocal Fluorescencia Transmisión Barrido Microscopía -Resumen

3 Algunos Conceptos… Resolución (D)Magnificación Aumento que logra el equipo Distancia mínima a la cual el equipo puede mostrar dos puntos como entidades separadas

4 ¿De qué depende la resolución? 0,5. λ Algunos Conceptos… n. senθ D = ¿Cómo disminuir D?

5 ¿De qué depende la resolución? 0,5. Algunos Conceptos… n. senθ D = Longitud de onda del haz de luz λ FILTRO AZUL

6 ¿De qué depende la resolución? Algunos Conceptos… 0,5. n. D = λ senθ Objetivo muestra LENTE CON AN MAYOR

7 ¿De qué depende la resolución? Algunos Conceptos… Índice de refracción Es el cambio de dirección que experimenta un rayo de luz cuando pasa de un medio transparente a otro también transparente. Este cambio de dirección está originado por la distinta velocidad de la luz en cada medio. n Aire : 1 n Aceite :1,5 0,5. n D = λ. senθ ACEITE DE INMERSIÓN

8 Microscopio óptico EL PORTAOBJETOS REVOLVER TORNILLOS DE

9 Microscopio óptico

10 Microscopio óptico - Campo claro - imágenes Eosinofilia

11 Microscopio óptico – Campo oscuro Observar organismos vivos sin necesidad de tinción Objetos brillantes sobre un fondo oscuro

12 Microscopio óptico – Campo oscuro - Imágenes Treponema pallidum

13 Aumenta pequeñas diferencias en el índice de refracción y densidad en la célula Microscopio óptico – Contraste de fase Observar organismos vivos sin necesidad de tinción El anillo forma un cono hueco de luz. El rayo de luz que atraviese la muestra va a retrasarse respecto del rayo que siga de largo luz sombra

14 Microscopio óptico – Contraste de fase

15 Células HeLa (Henrietta Lacks) Eritrocitos Humanos Zygnema Filamentous Algae Microscopio óptico – Contraste de fase

16 Microscopio óptico – Interferencia Permite la visualización detallada sin teñir Maximiza la diferencia entre los índices de refracción entre las partes de la muestra de forma de hacer visibles los limites celulares Mismo principio que el microscopio de contraste de fase pero utiliza luz polarizada

17 Microscopio óptico – Contraste de fase e interferencia - Imágenes Contraste de fase Interferencia diferencial

18 Los objetos pueden también visualizarse por la luz que ellos mismos emiten Microscopio óptico - Fluorescencia Restringe infrarrojo Pasa sólo la λ que permite la excitación del fluorocromo

19 Aequoria victoria Microscopio óptico - Fluorescencia Algunos objetos fluorescentes… GFP (Green fluorescent protein)

20 hela Drpspphila Célula de cebolla (peroxisomas)

21 Microscopio óptico - Fluorescencia - Confocal

22

23

24 Microscopía electrónica Microscopía electrónica de transmisión (TEM) Microscopía electrónica de barrido (SEM) Microscopía electrónica Estructura interna y detalles ultraestructurales Morfología y características de la superficie

25 Microscopía electrónica - Microscopio electrónico de transmisión (TEM)

26 Bacilos en divisiónMitocondria x Herpes virus ensamblándose en el núcleo Bacteria fagocitada por un macrófago Microscopía electrónica. Microscopio electrónico de transmisión (TEM)

27 Microscopía electrónica. Microscopio electrónico de barrido (SEM)

28 Glomérulo renal 1200x Célula en corte transversalPiel humana Espermatozoides bovinos Microscopía electrónica. Microscopio electrónico de barrido (SEM)

29 Célula vegetal con cristales (falsa tinción)Bacterias sobre un estoma Glób. Rojo Glób. Blanco Microscopía electrónica. Microscopio electrónico de barrido (SEM)

30 Microscopía óptica vs. electrónica

31 Elevados costos de los equipos y una infraestructura adecuada no permiten el uso de la técnica en cualquier laboratorio. Altos costos de procesamiento de las muestras La manipulación de reactivos se torna peligrosa por la elevada condición tóxica de los mismos. Procesamiento tedioso de la muestra. Creación de artefactos La complejidad de los equipos requiere de personal técnico especializado. Proporciona resultados de amplia resolución y magnificación Microscopía electrónica - Ventajas y desventajas

32 Microscopía de fuerza atómica (AFM)

33 Imágenes AFM de fibras de colágeno (izquierda) y ADN (derecha). Imágenes AFM de una célula viva en un medio de cultivo (izquierda) y cromosoma humano (derecha).

34 Microscopía de fuerza atómica (AFM) AFM images of M13 phage and mtDNA. M13 phage genomes before (A) and after (B) binding to SSB. Clayton et al, 2006.

35 ELISA Western blot Dot blot Inmunohistoquímica Inmunofluorescencia Citometría de flujo Técnicas inmunológicas Introducción a las Técnicas inmunológicas

36 Técnicas Inmunológicas - Inmunoglobulinas

37 Anticuerpo Antígeno Técnicas Inmunológicas - Producción de Inmunoglobulinas (anticuerpos) epitope Linfocito B Activación

38 Antígeno Técnicas Inmunológicas - Anticuerpos Epitope A Epitope C Epitope B Los antígenos suelen presentar múltiples copias del mismo epítope, y/o presencia de múltiples epítopes que son reconocidos por múltiples anticuerpos.

39 Técnicas Inmunológicas – Anticuerpos Policlonales Antigeno Activación Linfocitos B

40 Técnicas Inmunológicas – Anticuerpos Policlonales Suero Centrifugación Sangre Purificación

41 Técnicas Inmunológicas – Anticuerpos Monoclonales Antígeno Purificación de Linfocitos B Sangrado Cultivo de células tumorales + Fusión Hibridoma

42 Técnicas Inmunológicas – Anticuerpos Monoclonales Hibridomas Screening: Búsqueda de hibridoma positivo y aislamiento Purificación de anticuerpos monoclonales del sobrenadante de cultivo de los hibridomas

43 Técnica de enzimoinmunoensayo (ELISA) Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) Para detectar Antígenos Anticuerpos

44 ELISA ELISA Para detectar Anticuerpos SensibilizaciónBloqueo Incubación con Suero

45 ELISA ELISA Para detectar Anticuerpos LavadoAnticuerpo 2ºRevelado

46 ELISA ELISA Para detectar Antígenos SensibilizaciónBloqueo Incubación con Suero

47 ELISA ELISA Para detectar Anticuerpos LavadoAnticuerpo 2ºRevelado

48 Revelado – Detección Indirecta Revelado: Complejo biotina-avidina

49 Antígeno Ac. primario Ac. secundario Biotina Cromógeno Cromóforo Avidina Peroxidasa Revelado – Detección indirecta

50 Formación de colores por la acción enzimática de distintos cromógenos

51 Ventajas ELISA Gran número de muestras procesadas simultáneamente Muy sensible Resultados rápidos Cuantificación de sustancias diversas (hormonas, fármacos, etc.)

52 Western blot Western blot: identificación de proteínas Transferencia SDS - PAGE Gel Membrana Incubación con Ab y revelado Transferencia

53 Western blot BloqueoAnticuerpo 1º Anticuerpo 2º biotinilado Biotina-avidina + peroxidasa Revelado Sustrato coloreado que precipita al reaccionar Sustrato que emite luz al reaccionar con la enzima (revelado en placa radiográfica)

54 Ejemplo Western blot Membrana nitrocelulosa 50 Actina DAT Placas radiográficas Gel acrilamida

55 Dot blot DOT BLOT Dot blot analysis of proteins extracted from wild-type spores and from spores exposing a TTFC chimera. (Ricca and Cutting. Journal of Nanobiotechnology :6) Variante de las técnicas de Southern, Northern y Western blot Identificación de moléculas

56 Inmunohistoquímica Trozo de tejido Se corta en secciones muy finas y se coloca en un portaobjetos Anticuerpo 1ºAnticuerpo 2º biotinilado Avidina-peroxidasa Revelado Inmunohistoquímica: identificación en el tejido

57 Inmunohistoquímica - Revelado Anti MMP-13 revelado con DAB Contratinción hematoxilina

58 Inmunohistoquímica - Sustratos

59 Rodamina Fluoresceina Ficoeritrina DAPI Bromuro de Etidio Naranja de Acridina Inmunofluorescencia

60 N-myc/CD56 Rat neurons Inmunofluorescencia

61 Inmunofluorescencia-colocalización La colocalización permite determinar si dos antígenos se encuentran en el mismo lugar (nucleo, vacuola, retículo, etc) dentro de una célula

62 Inmunofluorescencia - colocalización

63 Citometría de Flujo CélulaMedida En movimiento Medida de las propiedades de las células mientras están en un flujo de líquido Inmunophenotipificación Viabilidad/apoptosis/Proliferación Ciclo celular Cambios en la superficie Actividad enzimática etc

64 Citometría de Flujo Mezcla de células Marcación con anticuerpos monoclonales

65 Citometría de Flujo La presión ejercida por una columna de fluido obliga a las células a enfilarse de a una

66 Citometría de Flujo Columna de células

67 Citometría de Flujo Laser Detector

68 Citometría de Flujo Tamaño Granularidad La luz que se detecta en la misma dirección del laser (forward) es detectada por el canal Forward Scatter Channel (FSC). La intensidad de la señal detectada se relaciona con el tamaño, y el indice de refracción de las células La luz que se detecta a 90 grados del haz del laser (side) es detectada por el canal Side Scatter Channel (SSC) La intensidad de la señal es proporcional a la cantidad de estructuras citosólicas en la célula (gránulos, inclusiones, etc)

69 Citometría de Flujo

70 Fluorescencia -Técnicas - Citometría de Flujo

71 Ejemplo: Selección del sexo a través de citometría de flujo de espermatozoides


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