MICROSCOPíA Y TÉCNICAS DE ESTUDIO CELULAR

Presentación del tema: "MICROSCOPíA Y TÉCNICAS DE ESTUDIO CELULAR"— Transcripción de la presentación:

1 MICROSCOPíA Y TÉCNICAS DE ESTUDIO CELULAR

2 Ópticos Tipos de microscopios Electrónicos Campo claro Campo Oscuro
Microscopía -Resumen Campo claro Campo Oscuro Contraste de fase Confocal Fluorescencia Ópticos Tipos de microscopios Electrónicos Transmisión Barrido

3 Distancia mínima a la cual el equipo puede mostrar
Algunos Conceptos… Magnificación Resolución (D) Aumento que logra el equipo Distancia mínima a la cual el equipo puede mostrar dos puntos como entidades separadas

4 ¿De qué depende la resolución?
Algunos Conceptos… ¿De qué depende la resolución? 0,5 . λ D = n . senθ ¿Cómo disminuir D?

5 ¿De qué depende la resolución?
Algunos Conceptos… ¿De qué depende la resolución? λ FILTRO AZUL Longitud de onda del haz de luz 0,5 . D = n . senθ

6 ¿De qué depende la resolución?
Algunos Conceptos… ¿De qué depende la resolución? 0,5 . λ D = senθ n . q Objetivo muestra LENTE CON AN MAYOR

7 ¿De qué depende la resolución?
Algunos Conceptos… ¿De qué depende la resolución? Es el cambio de dirección que experimenta un rayo de luz cuando pasa de un medio transparente a otro también transparente. Este cambio de dirección está originado por la distinta velocidad de la luz en cada medio. nAire: 1 nAceite:1,5 0,5 . λ D = n . senθ Índice de refracción ACEITE DE INMERSIÓN

8 Microscopio óptico TORNILLOS DE REVOLVER EL PORTAOBJETOS

9 Microscopio óptico

10 Microscopio óptico - Campo claro - imágenes
Eosinofilia

11 Observar organismos vivos sin necesidad de tinción Objetos brillantes
Microscopio óptico – Campo oscuro Objetos brillantes sobre un fondo oscuro Observar organismos vivos sin necesidad de tinción

12 Microscopio óptico – Campo oscuro - Imágenes
Treponema pallidum

13 Microscopio óptico – Contraste de fase
Aumenta pequeñas diferencias en el índice de refracción y densidad en la célula Observar organismos vivos sin necesidad de tinción El anillo forma un cono hueco de luz. El rayo de luz que atraviese la muestra va a retrasarse respecto del rayo que siga de largo luz sombra

14 Microscopio óptico – Contraste de fase

15 Microscopio óptico – Contraste de fase
Células HeLa (Henrietta Lacks) Eritrocitos Humanos Zygnema Filamentous Algae

16 Permite la visualización detallada sin teñir
Microscopio óptico – Interferencia Mismo principio que el microscopio de contraste de fase pero utiliza luz polarizada Permite la visualización detallada sin teñir Maximiza la diferencia entre los índices de refracción entre las partes de la muestra de forma de hacer visibles los limites celulares

17 Microscopio óptico – Contraste de fase e interferencia - Imágenes
diferencial

18 Microscopio óptico - Fluorescencia
Los objetos pueden también visualizarse por la luz que ellos mismos emiten Restringe infrarrojo Pasa sólo la λ que permite la excitación del fluorocromo

19 (Green fluorescent protein)
Microscopio óptico - Fluorescencia Algunos “objetos” fluorescentes… GFP (Green fluorescent protein) Aequoria victoria

20 Drpspphila hela Célula de cebolla (peroxisomas)

21 Microscopio óptico - Fluorescencia - Confocal

22 Microscopio óptico - Fluorescencia - Confocal

23 Microscopio óptico - Fluorescencia - Confocal

24 Microscopía electrónica
Microscopía electrónica de transmisión (TEM) Estructura interna y detalles ultraestructurales Microscopía electrónica de barrido (SEM) Morfología y características de la superficie

25 Microscopía electrónica - Microscopio electrónico de transmisión (TEM)

26 Microscopía electrónica. Microscopio electrónico de transmisión (TEM)
Bacilos en división Mitocondria x Bacteria fagocitada por un macrófago Herpes virus ensamblándose en el núcleo

27 Microscopía electrónica. Microscopio electrónico de barrido (SEM)

28 Microscopía electrónica. Microscopio electrónico de barrido (SEM)
Glomérulo renal 1200x Espermatozoides bovinos Célula en corte transversal Piel humana

29 Microscopía electrónica. Microscopio electrónico de barrido (SEM)
Bacterias sobre un estoma Célula vegetal con cristales (falsa tinción) Glób. Rojo Glób. Blanco

30 Microscopía óptica vs. electrónica

31 Proporciona resultados de amplia resolución y magnificación
Microscopía electrónica - Ventajas y desventajas Elevados costos de los equipos  y una infraestructura adecuada no permiten el uso de la técnica en cualquier laboratorio. Altos costos de procesamiento de las muestras La manipulación de reactivos se  torna peligrosa por la elevada condición tóxica de los mismos. Procesamiento tedioso de la muestra. Creación de artefactos La complejidad de los equipos requiere de personal técnico especializado. Proporciona resultados de amplia resolución y magnificación

32 Microscopía de fuerza atómica (AFM)

33 Microscopía de fuerza atómica (AFM)
Imágenes AFM de fibras de colágeno (izquierda) y ADN (derecha). Imágenes AFM de una célula viva en un medio de cultivo (izquierda) y cromosoma humano (derecha).

34 Microscopía de fuerza atómica (AFM)
AFM images of M13 phage and mtDNA. M13 phage genomes before (A) and after (B) binding to SSB. Clayton et al, 2006.

35 Introducción a las Técnicas inmunológicas
ELISA Western blot Dot blot Inmunohistoquímica Inmunofluorescencia Citometría de flujo

36 Técnicas Inmunológicas - Inmunoglobulinas

37 Anticuerpo Antígeno Linfocito B Activación
Técnicas Inmunológicas - Producción de Inmunoglobulinas (anticuerpos) Anticuerpo Linfocito B epitope Activación Antígeno

38 Antígeno Epitope A Epitope C Epitope B
Técnicas Inmunológicas - Anticuerpos Antígeno Epitope A Epitope C Epitope B Los antígenos suelen presentar múltiples copias del mismo epítope, y/o presencia de múltiples epítopes que son reconocidos por múltiples anticuerpos.

39 Técnicas Inmunológicas – Anticuerpos Policlonales
Antigeno Activación Linfocitos B

40 Sangre Suero Técnicas Inmunológicas – Anticuerpos Policlonales
Centrifugación Suero Purificación

41 + Fusión Técnicas Inmunológicas – Anticuerpos Monoclonales Antígeno
Cultivo de células tumorales Sangrado + Purificación de Linfocitos B Fusión Hibridoma

42 Técnicas Inmunológicas – Anticuerpos Monoclonales
Hibridomas Screening: Búsqueda de hibridoma positivo y aislamiento Purificación de anticuerpos monoclonales del sobrenadante de cultivo de los hibridomas

43 Para detectar Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)
Técnica de enzimoinmunoensayo (ELISA) Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) Para detectar Antígenos Anticuerpos

44 ELISA Para detectar Anticuerpos
Sensibilización Bloqueo Incubación con Suero

45 ELISA Para detectar Anticuerpos
Lavado Anticuerpo 2º Revelado

46 ELISA Para detectar Antígenos
Sensibilización Bloqueo Incubación con Suero

47 ELISA Para detectar Anticuerpos
Lavado Anticuerpo 2º Revelado

48 Revelado – Detección Indirecta
Complejo biotina-avidina

49 Revelado – Detección indirecta
Antígeno Ac. primario Ac. secundario Biotina Avidina Peroxidasa Cromógeno Cromóforo

50 Revelado – Detección indirecta
Formación de colores por la acción enzimática de distintos cromógenos

51 Ventajas ELISA Muy sensible Gran número de muestras procesadas simultáneamente Resultados rápidos Cuantificación de sustancias diversas (hormonas, fármacos, etc.)

52 Incubación con Ab y revelado
Western blot Western blot: identificación de proteínas SDS - PAGE Incubación con Ab y revelado Transferencia Membrana Gel Transferencia

53 Biotina-avidina + peroxidasa Revelado
Western blot Bloqueo Anticuerpo 1º Anticuerpo 2º biotinilado Biotina-avidina + peroxidasa Revelado Sustrato coloreado que precipita al reaccionar Sustrato que emite luz al reaccionar con la enzima (revelado en placa radiográfica)

54 Membrana nitrocelulosa
Ejemplo Western blot Gel acrilamida Membrana nitrocelulosa Placas radiográficas DAT Actina 250 160 105 75 50

55 Dot blot Variante de las técnicas de Southern, Northern y Western blot DOT BLOT Identificación de moléculas Dot blot analysis of proteins extracted from wild-type spores and from spores exposing a TTFC chimera. (Ricca and Cutting. Journal of Nanobiotechnology :6)

56 Inmunohistoquímica: identificación en el tejido
Se corta en secciones muy finas y se coloca en un portaobjetos Trozo de tejido Anticuerpo 1º Anticuerpo 2º biotinilado Avidina-peroxidasa Revelado

57 Inmunohistoquímica - Revelado
Anti MMP-13 revelado con DAB Contratinción hematoxilina

58 Inmunohistoquímica - Sustratos

59 Inmunofluorescencia Fluoresceina Ficoeritrina Rodamina Naranja
de Acridina DAPI Bromuro de Etidio

60 Inmunofluorescencia Rat neurons N-myc/CD56

61 Inmunofluorescencia-colocalización
La colocalización permite determinar si dos antígenos se encuentran en el mismo lugar (nucleo, vacuola, retículo, etc) dentro de una célula

62 Inmunofluorescencia - colocalización

63 Citometría de Flujo Citometría de Flujo Célula Medida En movimiento Medida de las propiedades de las células mientras están en un flujo de líquido Inmunophenotipificación Viabilidad/apoptosis/Proliferación Ciclo celular Cambios en la superficie Actividad enzimática etc

64 Citometría de Flujo Marcación con anticuerpos monoclonales Mezcla de células

65 Citometría de Flujo La presión ejercida por una columna de fluido obliga a las células a “enfilarse” de a una

66 Citometría de Flujo Columna de células

67 Citometría de Flujo Laser Detector

68 Granularidad Tamaño Citometría de Flujo
La luz que se detecta a 90 grados del haz del laser (side) es detectada por el canal Side Scatter Channel (SSC) La intensidad de la señal es proporcional a la cantidad de estructuras citosólicas en la célula (gránulos, inclusiones, etc) Granularidad Tamaño La luz que se detecta en la misma dirección del laser (forward) es detectada por el canal Forward Scatter Channel (FSC). La intensidad de la señal detectada se relaciona con el tamaño, y el indice de refracción de las células

69 Citometría de Flujo

70 Fluorescencia -Técnicas - Citometría de Flujo

71 Selección del sexo a través de citometría de flujo de espermatozoides
Fluorescencia -Técnicas - Citometría de Flujo Ejemplo: Selección del sexo a través de citometría de flujo de espermatozoides