Tema 3. Análisis estructural de enzimas. 1.-Determinación de la Masa molecular. 2.- Determinación de la composición aminoacídica y estructura primaria. 3.- Estructura secundaria y terciaria. Determinación estructural: RMN, Cristalografia. 4.- Estructura cuaternaria. Determinación sub-unidades, tipo Funcionalidad

1.- Determinación de la Masa molecular.

Cromatografía por filtración en gel: Tamaño Técnicas cromatográficas Las proteínas se separan por exclusión molecular mediante el uso de bolitas porosas de un polímero insoluble como dextrano o agarosa (Sephadex, Sepharosa). Técnicas cromatográficas Se determina Vo con Blue Dextran Ve se determina para cada proteína Vt se calcula de la fórmula  r 2 x h Kav =Ve-Vo / Vt-Vo

Se generan iones de las proteínas y se aceleran a través de un campo Espectrometria de masas MALDI-TOF: matrix-assisted laser desorption-ionization-time of flight ESI: electrospray ionization mass spectrometry MALDI-TOF Se generan iones de las proteínas y se aceleran a través de un campo eléctrico. Se determina el tiempo que tardan en ser detectados que es función de su masa.

Resultado de una espectrometría de masas

Información del peso molecular Permite la conversión en concentración de proteínas en solución a Molaridad Composición: ¿cuántos aminoácidos de un tipo hay en la molécula? 2.- Actividad catalítica ¿cuántas moléculas de substrato son transformadas por una molécula de enzima por segundo? 3.- Uniones a ligandos ¿cuántas moléculas de ligando se une por molécula de enzima?

(R-CO-NH-R) para formar péptidos 2.- Determinación de la composición aminoacídica y estructura primaria. Las proteínas son polímeros lineales formados por monómeros llamados aminoácidos Ayuda a conocer su mecanismo de acción. Identificación de regiones funcionales en una enzima 2. Interpretar datos estructurales cristalográficos, RMN. 3. La secuencia determina la estructura tridimensional Los aminoácidos se unen entre si mediante enlace covalente de tipo amida (R-CO-NH-R) para formar péptidos Las proteínas son polímeros lineales formados por monómeros llamados aminoácidos Enlace peptídico El equilibrio está más desplazado hacia la hidrólisis, por ello la formación del enlace requiere un aporte de energía (ATP). Sin embargo el enlace peptídico es cinéticamente muy estable y en ausencia de un catalizador, el tiempo de vida en disolución acuosa es de 1000 años.

Estructura primaria Enlace peptídico Corresponde a la posición de cada aminoácido en la secuencia codificada por el ADN Cada proteína tiene una secuencia de aas única y definida con precisión Enlace peptídico

METODOS TRADICIONALES DE SECUENCIACIÓN Composición aminoacídica de cadenas polipeptídicas Identificación del extremo amino terminal Reacciones del grupo amino: - Reacción de Edman: Fenilisotiocianato. Absorbancia a 254nm - Reacción de Sanger: 1-fluoro,2,4 dinitrobenceno (FDNB). Ab. 360nm - Reacción con el cloruro de dansilo: compuestos fluorescentes. - Reacción con la ninhidrina o fluoroescamina. compuestos fluorescentes.

Reacción de EDMAN l: 254 nm Fenilisotiocianato

Degradación de EDMAN Hasta 50 residuos contiguos de un polipéptido

Rotura de puentes disulfuros Polipéptidos de gran tamaño 1. Romper la proteína en fragmentos por métodos químicos o enzimáticos 2. Romper puentes disulfuros 3. Purificar cada fragmento y secuenciarlo por Degradación de EDMAN 4. Determinar el orden de los fragmentos y dónde se localizan, si los hay, los puentes disulfuros. Rotura de puentes disulfuros

Métodos para fragmentar las cadenas polipeptídicas

METODOS ACTUALES DE SECUENCIACIÓN Secuenciación MS-MS

Estructura secundaria 3.- Determinación de la estructura secundaria y terciaria. Estructura secundaria Disposición regular y repetida del esqueleto de la cadena polipeptídica en una dirección determinada. No se tienen en cuenta las cadenas laterales F y Sólo se permiten los giros alrededor de los enlaces Ca-N y Ca-C El carácter parcial de doble enlace del enlace peptídico limita la capacidad de rotación del mismo Los ángulos de giro (ángulos de torsión) se denominan: (fi) f y (psi)y.

Los valores para los giros fi y psi están comprendidos Estructura secundaria Los valores para los giros fi y psi están comprendidos entre 180º y -180º

Estructura secundaria ¿ Cuáles son los valores estéricamente permitidos ? Indica los valores de los ángulos fi y psi de conformaciones permitidas Plot de Ramachandran Las posibilidades de giro van a determinar en gran medida el plegamiento de las proteínas

Hoja b plegada a-Hélice Estructura secundaria En principio un péptido puede adoptar muchas conformaciones diferentes según los ángulos phi y psi Adopta la más favorable desde el punto de vista energético: menores impedimentos estéricos menor repulsión electrostática Existen dos tipos de estructuras secundarias termodinámicamente favorables a-Hélice Hoja b plegada

Estructura secundaria: a-hélice Puente de H n y n+4

Estructura secundaria: a-hélice f: - 57º y: - 47º

Radicales hacia el exterior ESTRUCTURA SECUNDARIA Estructura secundaria: a-hélice Radicales hacia el exterior de la hélice NO PARTICIPAN DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA

Restricciones para la formación de una a-hélice 1- Repulsión o atracción electrostática entre aminoácidos cargados. 2- Volumen de los grupos R adyacentes. No podrían ir seguidos varios aminoácidos voluminosos. 3- Interacciones entre cadenas laterales de aminoácidos separados por 3 ó 4 residuos. 4- Presencia de prolina. X-Pro.

R3 de la cadena adyacente) Estructura secundaria: hojas-b Los puentes de H conectan un residuo con dos residuos de la cadena adyacente (grupo NH de R1 y el CO de R2 de la cadena adyacente y entre el grupo CO de R1 y el NH de R3 de la cadena adyacente) Las hojas antiparalelas son más estables por la alineación de los puentes de H

Proteína globular con alto contenido en estructura b Concanavalina A

Las diferentes estructuras secundarias co-existen en una misma proteína

Estructura secundaria: giros, codos o lazos b Permiten el giro de 180º en la dirección de las cadenas polipeptídicas Estabilizado por puentes de H entre el aa1 y el aa4 (aai e aai+3)

Estructura suprasecundaria Agrupaciones estables de estructuras secundarias frecuentes en las proteínas. Motivos estructurales Todo alfa Todo beta Alfa-beta Unidad aa Meandro b Barril b Unidades bab

Estructura supersecundaria o motivos - Hélice-vuelta-hélice. - Siete hélices transmembrana. - Mano EF. - Cremallera de leucina. - Horquilla b. - Meandro b. - Barril b - Dedo de Zn. Todo alfa Todo beta Alfa-beta - Motivo bab

Siete hélices transmembrana Todo alfa Dos a-hélices yuxtapuestas Interaccionan entre sí mediante cadenas laterales de leucina (cremallera de leucina) Dos a-hélices cortas. Siete hélices transmembrana bacteriorrodopsina Mano EF Proteínas de unión al ADN reguladoras de la transcripción (c-fos, c-jun) Presente en proteínas que se unen a calcio como calmodulina o troponina

Dos estructuras b adyacentes orientadas de forma antiparalela Todo beta Horquilla beta Barril beta Dos estructuras b adyacentes orientadas de forma antiparalela Meandro b Proteína que se une al retinol humano

Proteínas de unión a ADN Alfa-beta Dedos de Zinc Estructuras alfas y betas unidas por un átomo de Zinc que interacciona con Cys e His Proteínas de unión a ADN

Dedo de Zn

Motivo bab

Estructura subterciaria Dominio: Parte de la cadena polipeptídica que tiene un plegamiento propio e independiente del resto de la proteína (Unidad de plegamiento). La unión estable de varios motivos da lugar a los dominios. Frecuentemente asociado a una función específica. Proteínas de más de 200 residuos

Estructura subterciaria Dominio Dominio Dominio Regiones de 100 a 150 aminoácidos

Disposición tridimensional de todos los átomos de una proteína Estructura terciaria Disposición tridimensional de todos los átomos de una proteína Mioglobina

Interacciones covalentes Estructura terciaria Fuerzas que estabilizan la estructura terciaria Interacciones débiles • Iónicas (puentes salinos) • Hidrofóbicas • Enlaces de hidrógeno • Fuerzas de Van derWaals Interacciones covalentes Entre restos de Cys

RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR

Núcleos en diferentes ambientes resonaran a frecuencias de radiación distintas

Proteína con 55 aminoácidos B-sheet

Efecto de la proximidad de dos núcleos NOESY “Nuclear Overhause Enhancement Spectroscopy” Muestra pares de protones muy cercanos menor de 5 A Magnetización se transfiere

Proteína de 55 aminoácidos Diagonal Primera dimensión

Genración de proteínas marcadas 13C, 15N y 2H RMN en tres dimensiones

Dominio de dedo de Zn

CRISTALOGRAFÍA RAYOS X Longitud de onda igual longitud que el enlace covalente

Proteínas cristalizan en la configuración biológica activa

Los electrones de los átomos dispersan los rayos X La forma de dispersión dependen del ordenamiento atómico

Transformación de Fourier Mapas de densidad electrónica

4. Estructura cuaternaria Hace referencia al ordenamiento de diferentes subunidades en una proteína multimérica Uniones no covalentes Interacciones débiles • Iónicas (puentes salinos) • Hidrofóbicas • Enlaces de hidrógeno • Fuerzas de Van derWaals

1. ¿Cuantas sub-unidades y de que tipo? Estudios de evaluación Peso Molecular Estudios de determinación de peso molecular. Agentes desnaturalizantes (Guanidina) Tipos y número de subunidades (precaución trazas de proteasas, al disociar las sub-unidades) Estudios de crosslinlinking Agentes químicos: Dimetilsuberimidato Desnaturalización SDS Págin 100 de Fundamentals Determinación Peso molecular SDS-PAGE 4X 3X 2X X

Alcohol DH Levadura 2 moles de NADH/mol ADH (Dímero) Estudios de uniones a ligandos Número de sitios de una enzima por un substrato indica el número de sub-unidades (Disposición de las sub-unidades) Alcohol DH Levadura 2 moles de NADH/mol ADH (Dímero) Hígado 4 moles de NADH/mol ADH (Tetramero) Estudios de simetria Estudios de Cristalografía Ejes de simetria Aspartato carbamoiltransferasa 6 unidades catalíticas y 6 regulatorias Estudios de identidad de sub-unidades Secuenciación N-terminal y C-terminal Espectrometría de masas de las sub-unidades

2.Enzimas oligoméricas: Funcionalidad 1. Aumenta la posibilidad de regulación catalítica 2. Variaciones en la propiedades catalíticas Ej.Triptofano Sintasa Proteínas Multienzimáticas. 3. Estabilidad. Lactato DH 4. Generación de estructuras complejas con funciones biológicas. Economía información genética Proteasoma