María Espino Hernández, Lic., MSc. Escuela Latinoamericana de Medicina

Determinación de la susceptibilidad in vitro Importante función del Laboratorio de Microbiología Clínica Monitorear niveles de resistencia Instauración de políticas terapéuticas

¿Era post- Antibiotica?

Muy pocos fármacos dirigidos al tratamiento de bacterias multirresistentes Muy pocos fármacos dirigidos al tratamiento de bacterias multirresistentes Pseudomonas aeruginosa Enterobacterias productoras de BLEE Estafilococos meticilino resistentes Pseudomonas aeruginosa Enterobacterias productoras de BLEE Estafilococos meticilino resistentes

 El desarrollo de nuevas drogas puede durar varios años.  Se necesita preservar la utilidad de los antimicrobianos disponibles a través de un uso óptimo y acertado.  Las combinaciones de antimicrobianos son comúnmente utilizadas en la práctica clínica  No obstante, el riesgo de provocar un efecto contrario al deseado, incrementar la toxicidad y los costos del tratamiento, no es poco frecuente.

Actividad Combinada de Antimicrobianos Objetivo: Lograr un efecto terapéutico más rápido e incrementado Técnica del Tablero Técnica de Curva de Muerte Métodos de Difusión E-test Técnica del Tablero Técnica de Curva de Muerte Métodos de Difusión E-test

 GENERAL Contribuir al conocimiento de la etiología y susceptibilidad de los agentes causales de la sepsis neonatal y a la aplicación adecuada del tratamiento antimicrobiano.  GENERAL Contribuir al conocimiento de la etiología y susceptibilidad de los agentes causales de la sepsis neonatal y a la aplicación adecuada del tratamiento antimicrobiano.  ESPECÍFICOS Caracterizar el comportamiento y la etiología de la sepsis neonatal durante el periodo de estudio. Describir el comportamiento de la resistencia bacteriana a los antimicrobianos utilizados. Identificar los patrones de resistencia de las cepas aisladas a los ß-lactámicos y aminoglucósidos.  ESPECÍFICOS Caracterizar el comportamiento y la etiología de la sepsis neonatal durante el periodo de estudio. Describir el comportamiento de la resistencia bacteriana a los antimicrobianos utilizados. Identificar los patrones de resistencia de las cepas aisladas a los ß-lactámicos y aminoglucósidos.

Evaluar los resultados del sinergismo in vitro e in vivo, entre las combinaciones de ß-lactámicos y aminoglucósidos aplicadas como tratamiento a los pacientes, tomando en cuenta el patrón de susceptibilidad de las cepas. Evaluar la eficacia del “tablero de damas” como procedimiento para orientar el tratamiento antimicrobiano combinado.

 163 pacientes (selección por expertos) y 533 aislamientos bacterianos. Tipo de estudio  Investigación analítica prospectiva y estudio retrospectivo longitudinal de tendencias. Marco de la investigación  Hospital Docente Ginecobstétrico “América Arias”, Enero diciembre Universo  534 pacientes con sepsis y cepas aisladas de hemocultivo. Muestra

APLICAR TRATAMIENTO ANTIMICROBIANO SEGÚN ANTIMICROBIANO SEGÚN PROGRAMA DE POLÍTICA REEVALUACIÓN DE LA TERAPÉUTICA horas HEMOCULTIVO 1ra. Resiembra horas incubación Aislamientoeidentificación Prueba de susceptibilidad y Sinergismo RECIEN NACIDO SEPTICO PACIENTE CON SIGNOS CLÍNICOS DE SEPSIS Algoritmo clínico-microbiológico para evaluar la eficacia del tratamiento antimicrobiano combinado

Microdilución en CMH-CA, Sinergismo  0,06-64 µg/mL  SUSCEPTIBILIDAD Y SINERGISMO ANTIMICROBIANO 0,5 McFarland, Dil.1:31 35 o C 24 h. 35 o C, 24 h. Cálculo de  CFI. (NCCLS, 1993; CLSI, 2006) CMI (µg/mL)  0,  - Estafilococos resistentes a meticilina, enterococos resistentes a vancomicina - Enterobacterias resistentes a todos los ß-lactámicos o todos los aminoglucósidos. - BNF resistentes a penicilinas de amplio espectro. - Estafilococos resistentes a meticilina, enterococos resistentes a vancomicina - Enterobacterias resistentes a todos los ß-lactámicos o todos los aminoglucósidos. - BNF resistentes a penicilinas de amplio espectro. AmikacinaAmpicilinaAzlocilinaCefazolinaCefotaximaCeftriaxonaGentamicinaKanamicinaOxacilina Penicilina G Vancomicina Antimicrobianos: Multirresistencia (CDC, 2006):

- Sinergismo (S):  CFI  0,5 - Sinergismo parcial o bajo (SP): 0,5 <  CFI < 1 - Indiferencia o adición (I): 1   CFI < 2 - Antagonismo (A):  CFI  2 - Sinergismo (S):  CFI  0,5 - Sinergismo parcial o bajo (SP): 0,5 <  CFI < 1 - Indiferencia o adición (I): 1   CFI < 2 - Antagonismo (A):  CFI  2 Antibiótico 1 (A1) (µg/mL) Antibiótico 2 (A2) (µg/mL) Índice de Concentración Fraccionaria Inhibitoria (CFI) (Berenbaum, 1978) Criterios de interpretación (Berenbaum, 1978; Eliopoulos, 1989) CMI A1/A2 CMI A2/A1  CFI = + CMI A1 solo CMI A2 solo Tablero de Damas (Checkerboard)

Leyenda: (a): Estafilococo coagulasa negativa; (b): Bacilos gramnegativos no fermentadores; (c): Estreptococo ß-hemolítico - (Shimabuku et al., 2004; Schrag y Schuchat, 2005; Alonso et al., 2005; Härtel et al., 2008) Figura 1. Agentes causales de sepsis neonatal. Hospital “América Arias”, Total: 533 aislamientos.

Tendencia: Tendencia: Incrementos significativos: ß-lactámicos (p  0,001) y amikacina (p  0,05) Resistencia bacteriana. Hospital “América Arias”, Patrones de resistencia principales (grampositivos): K-G: (51,4 y 48,7%) K-G-AK: (27,0 y 25,3%) K-G: (51,4 y 48,7%) K-G-AK: (27,0 y 25,3%) SARM (33,9%) ECNRM (64,8%) SARM (33,9%) ECNRM (64,8%)ß-lactámicos:Aminoglucósidos: - Enterococcus faecium (VanA) vancomicina-teicoplanina resistente (CMI  128 µg/mL) - Cuatro aislamientos ECNRM-vancomicina resistente (CMI  128 µg/mL)

Patrones de resistencia principales (gramnegativos): K-G: (20,7%) K-G-AK: (28,7%) K-G: (20,7%) K-G-AK: (28,7%) AM-AZ (32,2%) AM-AZ-KZ-CTX-CRO (33,3%) AM-AZ (32,2%) AM-AZ-KZ-CTX-CRO (33,3%) ß-lactámicos: Aminoglucósidos : Enterobacterias: K-G: (23,6%) K-G-AK: (29,2%) K-G: (23,6%) K-G-AK: (29,2%) AM-KZ-CTX-CRO (31,9%) AM-AZ-KZ-CTX-CRO (40,3%) AM-KZ-CTX-CRO (31,9%) AM-AZ-KZ-CTX-CRO (40,3%) ß-lactámicos: Aminoglucósidos : BNF:

Hospital Docente Ginecobstétrico “América Arias”.Enero 1993-diciembre Combinaciones ensayadas y pacientes evaluados: 163 Combinaciones ensayadas y pacientes evaluados: 163 Penicilina G/kanamicina Penicilina G/gentamicina Penicilina G/amikacina Azlocilina/amikacinaCefazolina/amikacinaCefotaxima/amikacinaCeftriaxona/amikacinaMeticilina/gentamicinaMeticilina/amikacinaMeticilina/kanamicina Sinérgicas: 56 Parcialmente sinérgicas: 25 Indiferentes: 71 Antagónicas: 10 Resultados in vitro de la interacción entre los fármacos probados Resultados in vitro de la interacción entre los fármacos probados

Resultados del sinergismo in vitro. InteracciónÍndice  CFI Disminución de CMI (µg/mL) (Media geométrica) ß-lactámicoAminoglucósido Sinérgico0,2761/81/32 Sinérgico parcial0,6641/21/4 Indiferente1,09701/128 Antagónico200 Tabla 1. Valores de Concentración fraccionaria inhibitoria y Concentración mínima inhibitoria en las combinaciones ensayadas

Interacción in vitro (a) Eficacia clínica del tratamiento (b) EficazNo eficazTotal Sinérgico51556 Sinérgico parcial18725 Indiferente Antagónico010 Total p (a-b)  0,001 (3 gl);  2 = 37,32 Tabla 2. Relación entre el sinergismo in vitro y la eficacia clínica del tratamiento

Interacción in vitro (a) Patrón de susceptibilidad de la cepa a los fármacos combinados (b) Sensible a uno de los dos Resistente a los dos Total Sinérgico Sinérgico parcial Indiferente Antagónico010 Total Tabla 3. Relación entre el sinergismo in vitro y la susceptibilidad de las cepas a los antimicrobianos de la combinación ensayada p (a-b) =0,014 (3 gl);  2 = 10,59

Leyenda: P= penicilina; OX= oxacilina; KZ= cefazolina; CTX= cefotaxima; CRO= ceftriaxona; K= kanamicina; G= gentamicina; AK= amikacina; AM= ampicilina; AZ= azlocilina. Patrones de 34 cepas bacterianas multirresistentes con las que se obtuvo sinergismo in vitro

NoPatrónAgente CausalTotal 1AM-K-GEnterobacter1 2AM-AZ-KE. coli1 3AM-AZ- K-GBNF1 4AM-AZ-KZ-KE. coli1 5AM-AZ-KZ-K-G-AKEnterobacter1 6AM-AZ-KZ-CTX-CRO-K-GEnterobacter1 7P-OX-KZ-CTX-CRO-K-GECN2 8AM-AZ-KZ-CTX-CRO-K-G-AKBNF2 Tabla 4. Patrones de resistencia de 10 cepas con las que se obtuvo antagonismo in vitro Leyenda: AM= ampicilina; K= kanamicina; G= gentamicina; AZ= azlocilina; KZ= cefazolina; AK= amikacina; CTX= cefotaxima; CRO= ceftriaxona; P= penicilina; OX= oxacilina

Susceptibilidad de la cepa a los fármacos combinados (a) Eficacia clínica del tratamiento (b) EficazNo eficazTotal Sensible a uno de los dos Resistente a los dos Total P (a-b) =0,119 (1 gl);  2 = 2,42 Tabla 5. Relación entre la susceptibilidad de las cepas a los antimicrobianos de la combinación probada y la eficacia clínica del tratamiento

Tabla 6. Eficacia del Tablero de Damas como procedimiento diagnóstico.  Verdaderos positivos (VP)= 37; Falsos positivos= 70; Verdaderos negativos (VN)= 51; Falsos negativos (FN)= 5 Parámetro Valor (%) IC (95%) Sensibilidad88,1086,85 – 89,35 Especificidad42,1541,68 – 42,62 Valor predictivo positivo34,5834,06 – 35,10 Valor predictivo negativo91,0790,13 – 92,01 Razón de verosimilitud positiva1,52 Razón de verosimilitud negativa0,28

Paciente con sepsis grave por microorganismo multirresistente Paciente con sepsis grave por microorganismo multirresistente Sensibilidad: 88,10% Valor Predictivo Negativo: 91,07% Sensibilidad: 88,10% Valor Predictivo Negativo: 91,07% Método: “Tablero de Damas” PRUEBA DE SCREENING VALIOSA

 El panorama epidemiológico de la sepsis neonatal se mantuvo estable durante el periodo analizado con una mayor incidencia de estafilococos en la sepsis precoz y la tardía.  La resistencia global a los antimicrobianos fue elevada, y se incrementó significativamente para cefalosporinas, gentamicina, amikacina y para oxacilina en cocos grampositivos.  Se encontró una amplia variedad de patrones de resistencia para ß-lactámicos en bacterias gramnegativas y fueron frecuentes los patrones kanamicina-gentamicina y kanamicina-gentamicina-amikacina en todas las cepas.  Las combinaciones de fármacos sinérgicas in vitro mostraron una elevada probabilidad de eficacia para el tratamiento, con independencia del patrón de susceptibilidad de la cepa y de si ésta fue o no resistente a los dos antibióticos combinados.

 La probabilidad de obtener eficacia clínica con la fusión de antimicrobianos con sinergismo parcial in vitro, fue la misma que se obtuvo con las combinaciones cuyo resultado fue indiferente y todos los resultados antagónicos in vitro se correspondieron con falla clínica del tratamiento in vivo, corroborando así, que el criterio asumido en este estudio fue adecuado.  El método del tablero de damas fue un buen procedimiento diagnóstico para predecir los tratamientos ineficaces y para advertir la probabilidad de una terapéutica eficaz cuando la prueba fue sinérgica.

“Tablero de Damas y Microdilución. Especificaciones Técnicas y Algoritmo de Trabajo para su aplicación en la práctica Clínico-Microbiológica” Autor: Prof. María Espino Hernández Asesores: Prof. Jorge L. Zuazo Silva Dra. Isabel Martínez Mota Escuela Latinoamericana de Medicina, 2008 (Metodología para evaluar combinaciones de fármacos in vitro y su eficacia en el paciente)

Partes componentes: TABLA DE CONTENIDO RESUMEN INTRODUCCIÓN ANTECEDENTES y OBJETIVOS SECCIONES (1 a la 5) BIBLIOGRAFÍA ANEXOS (Tablas, esquemas y Figuras)

SECCIONES 1 1 Selección y preparación de los antimicrobianos 2 2 Métodos Procedimientos para el control de la calidad 3 3

Comentarios a los procedimientos de microdilución y el tablero de damas Algoritmo de trabajo microbiológico