SLUG como marcador molecular de células tumorales aisladas (CTAs) en sangre periférica (sp) en cáncer de mama matastásico (CMM) Papel de la detección de CTAs en SP de pacientes (pts.) con CMM Correlación con supervivencia

Su expresión puede considerarse un marcador de mal pronóstico Cáncer de mama y expresión de SNAI-2 (SLUG) en sangre periférica SNAI2 (SLUG) Familia de factores de transcripción zinc-finger. Reprime la transcripción de E-cadherina Su expresión puede considerarse un marcador de mal pronóstico FUNCIONES 1. Inducción de procesos de Transición epitelio-mesénquima (TEM) Propiedades migratorias e invasivas en c. tumorales  Fenotipo invasivo 2. Inducción de supervivencia Ventaja selectiva para las células en migración Potente protector de la muerte celular Resistencia a la apoptosis Resistencia a radiaciones IMPLICACIONES Marcador molecular de stem cell cancer

Stem Cells vs. Cancer Stem Cells Cáncer de mama y expresión de SNAI-2 (SLUG) en sangre periférica Autorrenovación (Self-renewal): capacidad para dividirse múltiples veces sin perder su estado de desdiferenciación Potencia ilimitada: capacidad para diferenciarse y especializarse hacia cualquier tipo de célula madura, de acuerdo a las condiciones fisiológicas en que se encuentren Especializacion: células NO especializadas, INDIFERENCIADAS ( no tiene ninguna función específica) Stem Cells vs. Cancer Stem Cells Su desarrollo se debe a mutaciones que se acumulan en las stem cell normales durante años y que alteran las vias de señalización que controlan la proliferación, diferenciación celular

SELECCIÓN DE PACIENTES Y EXTRACCIÓN DE MUESTRAS Cáncer de mama y expresión de SNAI-2 (SLUG) en sangre periférica SELECCIÓN DE PACIENTES Y EXTRACCIÓN DE MUESTRAS 1/12/2003 AL 4/07/2005 757 muestras de sangre periférica 242 pacientes 100 voluntarios, controles sanos Consentimiento informado 172 con afectación locorregional 70 metastásicas En el período comprendido entre el 1 de Diciembre de 2003 y el 4 de Julio de 2005 se realizó la extracción de un total de 757 muestras de sangre periférica que correspondieron a 242 pacientes diagnosticadas de cáncer de mama (172 con afectación locorregional y 70 metastásicas) y tratadas en el Servicio de Oncología del Hospital Universitario de Salamanca y a 100 voluntarios, controles sanos. En todos ellos se realizó la extracción de 6ml. de sangre periférica, en condiciones estériles en tubos “Venoject” de 10ml. con EDTA. Entre las 172 pacientes diagnosticadas de cáncer de mama precoz, la recogida de las muestras se realizó antes del inicio del tratamiento quimioterápico adyuvante en 55 de ellas. En el 117 restante la extracción se realizó una vez iniciado éste y siempre antes de administrar un ciclo de quimioterapia. Todas las muestras fueron identificadas y relacionadas con las respectivas historias clínicas. Tanto para las pacientes como para los controles se solicitó la firma del consentimiento informado realizado específicamente para este fin. Los resultados obtenidos y los datos de cada paciente se almacenaron en una base de datos duplicada que se creó a tal efecto con los software informáticos “Filemaker pro” y “Excel”. 4

No correlación con variables analizadas Cáncer de mama y expresión de SNAI-2 (SLUG) en sangre periférica SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD GRUPO n SLUG + Test exacto de Fisher p-valor CONTROLES 100 9% CMM 70 51.4% <,001 n SLUG + % Test exacto de Fisher p-valor Cáncer de mama precoz 19 34,50% Cáncer de mama metastásico 36 51,4% ,071 El índice de detección de mRNA de SLUG en sangre periférica de controles sanos mediante RT-PCR fue del 9% (9/100) en comparación con el 34.5% en pacientes con cáncer de mama precoz y con el 51.4% en pacientes con cáncer de mama metastásico (Tablas 18, 19, 20 y 21), encontrándose diferencias estadísticamente significativas entre los diferentes grupos (Test exacto de Fisher, p <,001). Tabla 22. El índice de detección fue mayor en el grupo de pacientes con CMM (51.4%), aunque no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre el índice de detección en pacientes con CM precoz y CMM (34,5 vs 51,4%, Test exacto de Fisher, p= 0,071). Tabla 23. No correlación con variables analizadas EDAD, GRADO, RH, HER2, Nº MTS, LOCALIZACIÓN MTS, TRATAMIENTOS ADMINISTRADOS: ADYUVANCIA, PARA LA ENFERMEDAD MTS (TIPO O Nº) 5

ANÁLISIS DE SUPERVIVENCIA Cáncer de mama y expresión de SNAI-2 (SLUG) en sangre periférica ANÁLISIS DE SUPERVIVENCIA Seguimiento Estadístico Total Media 59,26 IC media 95% 54,14 – 64,39 Mediana 64,71 semanas Progresión Frecuencia Porcentaje No 20 28,6 Situación actual Respuesta 25 35,7 Estabilización 11 15,7 15 21,4 Exitus 19 27,1 Con una mediana de seguimiento de 64,71 semanas - 16 meses - (Rango: 7 semanas - 85.14 semanas) la situación de las pacientes es como sigue: progresaron tras la extracción de sangre periférica el 71,4% (50/70). Al final del seguimiento la situación es la siguiente: en respuesta 35,7%, estabilizadas 15,7%, en progresión 21,4% y fallecidas 19 pacientes (27,1%) Mediana de SLP 44,14 semanas (EE: 9,78; IC 95%: 24,97-63,32) 6

SUPERVIVENCIA LIBRE DE PROGRESIÓN (SLP) Cáncer de mama y expresión de SNAI-2 (SLUG) en sangre periférica SUPERVIVENCIA LIBRE DE PROGRESIÓN (SLP) Estratificando por SLUG SLUG Estadístico Valor EE IC 95% Positivo Mediana (P50) 26,71 5,04 16,84 36,59 Negativo 54,00 4,40 45,38 62,62 Estadístico g.l. p-valor Log-Rank 2,80 1 0,0945 Breslow 3,59 0,0580 Tarone-Ware 3,50 0,0614 Menor SLP en pacientes SLUG + En el límite de la significación estadística 7

Variables independientes para el riesgo de progresión Cáncer de mama y expresión de SNAI-2 (SLUG) en sangre periférica SUPERVIVENCIA LIBRE DE PROGRESIÓN (SLP) Riesgo de progresión Análisis multivariante Variables independientes para el riesgo de progresión Expresión de SLUG + 3 o más líneas de tratamiento 3 o más localizaciones metastásicas En nuestro estudio, las variables que influencian de manera negativa el riesgo de progresión son el grado (grado III con un RR: 0,504; IC 95%: 0,261 - 0,974; p-valor= 0,041), y la presencia de 3 o más localizaciones metastásicas (RR: 0,012; IC 95%: 0,00 - 0,384; p-valor= 0,012). El debut como paciente metastásica y por lo tanto no haber recibido ninguna linea de tratamiento previa para la enfermedad metastásica se muestran como variables asociadas a un menor riesgo de progresión (RR: 2,173; IC 95%: 1,017 - 4,643; p-valor= 0,045 y RR: 1,162; IC 95%: 1,039 - 1,300; p-valor= 0,09) 8

SUPERVIVENCIA GLOBAL (SG) Cáncer de mama y expresión de SNAI-2 (SLUG) en sangre periférica SUPERVIVENCIA GLOBAL (SG) Estratificando por SLUG SLUG Estadístico Valor Error Estándar Intervalo de Confianza al 95% Positivo Media 70,72 3,91 63,05 78,39 Negativo 75,85 3,12 69,75 81,96 Estadístico g.l. p-valor Log-Rank 0,82 1 0,3656 Breslow 1,07 0,3016 Tarone-Ware 0,97 0,3235 Menor SG en pacientes SLUG + No Significativo 9

SLUG: CÉLULAS STEM DE CM Cáncer de mama y expresión de SNAI-2 (SLUG) en sangre periférica CONCLUSIONES La detección de de CTAs por RT-PCR es una técnica que se muestra factible Poco agresiva Fácilmente reproductible Nuevo marcador molecular de CTAs en sp. En nuestro estudio su detección se muesta como un factor pronóstico adverso sobre la SLP y podría discriminar subgrupos de peor pronóstico SLUG: CÉLULAS STEM DE CM Células con potencial metastásico Marcador molecular con valor pronóstico Mantenimiento tumoral Resistencia a tratamientos y recaídas Actitudes terapéuticas diferentes a convencional

Se incluyeron para el estudio 70 pacientes con cáncer de mama metastásico. Las características de las pacientes se resumen en las Tablas 29, 30, 31 y 32. La mediana de edad de estas pacientes fue de 60 años (rango: 30-56). 52 de ellas eran postmenopáusicas (74,3%), con más de 50 años el 64,3%, siendo la histología ductal la más frecuente del grupo (87,5%) y el grado histológico III (72,9%). El 30% de las pacientes de nuestro estudio presentaron HER2 positivo (2+ o 3+ por IHC no confirmado por FISH). HER2 +++ por IHC se detectó en 12 pacientes (17%). Se detectó p53 negativo en el 58% y más del 60% de las pacientes tenían Receptores hormonales positivos. De las 70 pacientes incluidas en el estudio, 17 (24.3%), debutaron como metastásicas y el resto (75,7%) eran pacientes con recaídas previas. En estas últimas el tratamiento adyuvante más frecuentemente recibido fue un régimen de quimioterapia conteniendo antraciclinas (41,4%). El tipo de tratamiento más frecuentemente recibido para la enfermedad metastásica fue quimioterapia sin herceptín (55,7%). 30 pacientes (42,9%) iniciaban un tratamiento de primera linea para la enfermedad metastásica, y el resto ya habían recibido alguna línea previa, siendo lo más frecuente haber recibido alguna línea de tratamiento con quimioterapia y hormonoterapia (31,4%), con una media de líneas de tratamiento administradas antes de la extracción de 3 (rango:0-8). En relación a la enfermedad metastásica, el 55,7% de las pacientes contaban con más de una localización metastásica y el 44,3% tenían metástasis viscerales. Tras la progresión y hasta el fin del seguimiento el tratamiento más frecuentemente recibido por las pacientes fue alguna línea diferente de quimioterapia y hormonoterapia. 11 pacientes recibieron tratamiento con herceptín en diferentes combinaciones con HT, QT o QT y HT. 11

Metastásicas de evolución Mediana de 3 líneas de tratamiento previo CARACTERÍSTICAS DE LAS PACIENTES CM METASTÁSICO Mediana edad: 60 años Postmenopáusicas Tumores de alto grado RH positivos Metastásicas de evolución Mediana de 3 líneas de tratamiento previo Combinación de QT-HT Metástasis no viscerales Más de 1 localización metastásica Se incluyeron para el estudio 70 pacientes con cáncer de mama metastásico. Las características de las pacientes se resumen en las Tablas 29, 30, 31 y 32. La mediana de edad de estas pacientes fue de 60 años (rango: 30-56). 52 de ellas eran postmenopáusicas (74,3%), con más de 50 años el 64,3%, siendo la histología ductal la más frecuente del grupo (87,5%) y el grado histológico III (72,9%). El 30% de las pacientes de nuestro estudio presentaron HER2 positivo (2+ o 3+ por IHC no confirmado por FISH). HER2 +++ por IHC se detectó en 12 pacientes (17%). Se detectó p53 negativo en el 58% y más del 60% de las pacientes tenían Receptores hormonales positivos. De las 70 pacientes incluidas en el estudio, 17 (24.3%), debutaron como metastásicas y el resto (75,7%) eran pacientes con recaídas previas. En estas últimas el tratamiento adyuvante más frecuentemente recibido fue un régimen de quimioterapia conteniendo antraciclinas (41,4%). El tipo de tratamiento más frecuentemente recibido para la enfermedad metastásica fue quimioterapia sin herceptín (55,7%). 30 pacientes (42,9%) iniciaban un tratamiento de primera linea para la enfermedad metastásica, y el resto ya habían recibido alguna línea previa, siendo lo más frecuente haber recibido alguna línea de tratamiento con quimioterapia y hormonoterapia (31,4%), con una media de líneas de tratamiento administradas antes de la extracción de 3 (rango:0-8). En relación a la enfermedad metastásica, el 55,7% de las pacientes contaban con más de una localización metastásica y el 44,3% tenían metástasis viscerales. Tras la progresión y hasta el fin del seguimiento el tratamiento más frecuentemente recibido por las pacientes fue alguna línea diferente de quimioterapia y hormonoterapia. 11 pacientes recibieron tratamiento con herceptín en diferentes combinaciones con HT, QT o QT y HT. 12