Electroforesis

F=q.E q.E=m.a a=(q/m) E si v i =0 d=(q/m)E t 2 /2 ????

F=q.E q.E=F e q.E – ŋ.v = m.a d = (q.E/ ŋ)t+A.exp[-(ŋ/m)t]+B v=q.E/ ŋ-A.(ŋ/m).exp[-(ŋ/m)t] a= A. (ŋ/m) 2.exp[-(ŋ/m)t] q.E/ ŋ v t

Electroforesis en gel

Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE)

SDS-PAGE [CH 3 -(CH 2 ) 10 -CH 2 -O-SO 3 ]Na + DOCECIL SULFATO DE SODIO (SDS)

Isoelectro- enfoque

Determinación de la estructura primaria Preparación de la proteína para secuenciación ● Determinar el número de cadenas polipeptídicas ● Cortar los puentes de disulfuro ● Separar y purificar cada subunidad (cadena). ● Determinar la composición de aminoácidos de cada subunidad.

Secuenciación de cadenas polipeptídicas ● Fragmentar cada subunidad en puntos específicos para obtener péptidos suficientemente pequeños para ser secuenciados directamente. ● Separar y purificar los fragmentos. Determinar la secuencia de aminoácidos de cada fragmento peptídico. ● Repetir el 1er paso con cortes de diferente especificidad y concluir la nueva secuenciación.

Organizar la estructura primaria ● Organizar las secuencias encontradas en los dos sistemas de corte de tal manera que correspondan a una única secuencia. ● Determinar la posición de los puentes de disulfuro, tanto intra- como inter-cadenas, si existieran.

Determinación de la secuencia de aminoácidos de cada fragmento peptídico. ¿Como obtener, no sólo la composición de aminoácidos sino además el orden en que se encuentran en la secuencia? Existen dos tipos de métodos: - Quitar secuencialmente por métodos químicos, uno a uno, los aminoácidos. -Cortar en muchos segmentos e identificar la secuencia de cada trozo pequeño o su último residuo y el orden de los fragmentos.

Degradación de Edman

Reconocimiento de las derivadas tio-fenil- hidantoinas de los aminoácidos por HPLC de fase reversa.

Síntesis de péptidos

Protección del NH2

Fijación a la resina

Desprotección exclusiva del amino-terminal

Acoplamiento de aminoácidos

Desprotección de los grupos protegidos en diferentes cadenas laterales.

Separación del polipéptido de la resina

Estructura tridimensional de proteínas Su importancia ● La función de las proteínas depende esencialmente de su conformación. ● Permite interpretar los fenómenos biológicos a nivel atómico. ● La estructura tridimensional sirve de base para crear modelos sobre los procesos biológicos (ejemplos).