CRECIMIENTO MICROBIANO

¿Que necesitan los organismos para vivir? - Requerimientos nutricionales (alimento) -Condiciones físicas (Temperatura, pH, actividad del agua…)

Requerimientos nutricionales Los organismos necesitan obtener energía y materias primas para poder realizar sus actividades metabólicas y desarrollar todo su ciclo vital. En términos nutricionales y de acuerdo a la cantidad se puede decir que requieren de: MACRONUTRIENTES MICRONUTRIENTES FACTORES DE CRECIMIENTO

MACRONUTRIENTES Agregados en cantidades de gramos por litro que están representados por las fuentes de C, N, S, P, K y Mg.

MICRONUTRIENTES o elementos trazas representados por las sales de Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co que se agregan a los medios en cantidades de miligramos o microgramos por litro.

FACTORES DE CRECIMIENTO Componentes orgánicos que no son sintetizados ni metabolizados por las células, sino incorporados a estructuras celulares (vitaminas, pseudovitaminas).

Composición ELEMENTAL de un microorganismo Componentes de las células (% peso seco)  Carbono  50%  Oxígeno 32%  Nitrógeno 14% (NH4 )   Fósforo 3% (PO 43-) Azufre 1% (SO42-) Elementos traza  Fe, K, Mg, Mn, Co, Mb, Cu y Zn.

Composición elemental de células microbianas (% peso en base seca) Elemento Bacterias Levaduras Mohos Carbono 46-52 46 - 52 45-55 Hidrógeno Entre 8 y12 Oxígeno 18 - 24 Nitrógeno Entre 10 y 14 Entre 5 y 9 Entre 3 y 7 Magnesio 0,1 - 0,5 0,1 - 0,3 Fósforo 2,0 - 3,0 0,8 - 0,25 0,4 - 4,5 Azufre 0,1 - 1,0 0,01 - 0,025 Calcio 0,01 - 1,0 0,1 - 1,4 Potasio 1,0 - 4,5 1,0 - 4,0 0,2 -2,5 Hierro 0,02 - 0,2 0,01 - 0,5 0,1 - 0,2 Otros <0,01

Relacion de composiciones en la formulación de un medio 100:10:(1-5) C:N:P Composición de Biomoléculas en células microbianas (% peso en base seca) Compuesto Bacterias Levaduras Mohos Proteínas 50 - 60 35 - 60 25 - 40 Carbohidratos Entre 6 - 15 30 - 45 40 - 55 Lípidos Entre 5 y 10 Ac. Nucléicos 15 - 25 Entre 5 y 15 Entre 2 y 10 Cenizas Entre 4 y 10

FACTORES FÍSICO-QUÍMICOS Temperatura pH Actividad del agua (aw) Potencial Redox

TEMPERATURA k(T): constante cinética (dependiente de la temperatura) Relación temperatura-velocidad de crecimiento (ecuación de Arrhenius) k(T)= A*exp(-Ea/RT) k(T): constante cinética (dependiente de la temperatura) A: factor preexponencial o factor de frecuencia. Refleja la frecuencia de las colisiones. Ea: energía de activación, expresada en kJ/mol. R: constante universal de los gases. Su valor es 8,3143 J·K-1·mol-1 T: temperatura absoluta [K]

Efectos biológicos de la temperatura en la célula Temperaturas cardinales: mínima, máxima y óptima

Clases de microorganismos según la temperatura de crecimiento

pH Acidófilos Neutrófilos Alcalófilos Aunque los microorganismos pueden crecer en un margen más o menos amplio de pH (alrededor de un óptimo), los cambios bruscos pueden ser lesivos (afectando a la membrana y al transporte de solutos, e inhibiendo enzimas). Acidófilos Neutrófilos Alcalófilos

Efectos del pH sobre la velocidad de crecimiento: a. Hongos. b Efectos del pH sobre la velocidad de crecimiento: a. Hongos. b. Bacterias

aW = P/Po Actividad de agua (aw) El valor de la actividad de agua nos da una idea de la cantidad de agua disponible metabólicamente. Conforme aumenta la cantidad de solutos en el medio, disminuye su actividad de agua. aW = P/Po P = presión de vapor del agua en una solución Po = presión de vapor del agua pura 0 < aW < 1

ACTIVIDAD DE AGUA DE DIVERSAS SUSTANCIAS Actividad de agua aw Material Organismo que crece 1.000 0.995 0.980 0.950 0.900 0.850 0.800 0.750 0.700 Agua pura Sangre Humana Agua Marina Pan Jarabe de arce, jamón Chorizo Pasteles de frutas, mermeladas Pescado salado Cereales, caramelos Frutos secos Caulobacter Spirillum Streptococcus, E. coli Pseudomonas, Vibrio Bacilos Gram positivos Cocos Gram positivos Levaduras Hongos filamentosos Halobacterium, Halococcus Hongos xerofílicos

Actividad del agua para diversos microorganismos

CLASIFICACION DE LOS MICROORGANISMOS DE ACUERDO A SU TOLERANCIA A LAS SALES DISUELTAS EN EL AGUA

Potencial Redox CAPACIDAD DEL SUSTRATO DE: ACEPTAR ELECTRONES DONAR ELECTRONES CARACTERÍSTICA OXIDANTE CARACTARÍSTICA REDUCTORA Cuando un microorganismo requiere un ambiente oxidante se dice que desarrolla un metabolismo oxidativo (o respirativo) mientras que los microorganismos que requieren ambientes reductores (o menos oxidantes) realizan un metabolismo fermentativo.

Clasificación de los organismos con respecto al consumo de oxígeno Aerobios Microaerófilos Anaerobios facultativos Anaerobios estrictos u obligados

Hay microorganismos que viven en ambientes anaerobios que llevan a cabo un metabolismo oxidativo porque usan otro aceptor final de electrones que actúa como oxidante ambiental. (nitratos (NO3-), sulfatos (SO42-) u otros compuestos orgánicos oxidados).

Crecimiento En Organismos multicelulares En Unicelulares Implica un aumento ordenado de todos los componentes de un organismo y no solamente de alguno de ellos. El crecimiento conduce a un aumento en el número de células más que en el tamaño celular.

DIVISIÓN CELULAR EN ORGANISMOS UNICELULARES

¿VIABILIDAD DE LOS MICROORGANISMOS?

Fed-Batch (lotes alimentados) Con los nutrientes necesarios y las condiciones físico-químicas adecuadas se puede realizar el cultivo de microorganismos de las siguientes formas: Batch (lotes) Fed-Batch (lotes alimentados) Continuo

Ciclo de crecimiento de las poblaciones microbianas

FASE LAG Etapa lenta o de retardo lag: Adaptación enzimática al tipo de sustrato. Adaptación a la concentración y condiciones de operación. Las células están vivas pero no se reproducen (hacen un censo del medio y las condiciones físicas)

CRECIMIENTO EXPONENCIAL Es el tipo de crecimiento donde el número de células se duplica cada cierto tiempo

VARIACION DE LA BIOMASA La velocidad en la variación de la concentración de celular conocida también como la VELOCIDAD DE CRECIMIENTO en el número de células o en la masa celular) se puede expresar así: dN/dt = (biomasa que nace)-(biomasa que muere) dN/dt = µN - KdN

dN/dt= rata de crecimiento dN/dt=µN dN/dt=0 dN/dt=-Kd N Donde: dN/dt= rata de crecimiento N= Número de células o biomasa en el tiempo t, µ= velocidad específica de crecimiento (t-1 ), Kd = constante de velocidad de muerte ceular

Tiempo de generación tg El tiempo requerido para duplicar el número de células de una población Tiempo de generación tg Cambio instantáneo en el # relativo de células en un intervalo de tiempo Velocidad específica de crecimiento µ El recíproco del tiempo de generación (generaciones/unidad de tiempo) Constante de velocidad K

CALCULO DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR EN EL TIEMPO Nf =No 2n Nf =No 2t/tg n=t/tg Donde: N= Número de células o biomasa en el tiempo (t), No = Concentración inicial de células o biomasa, n= número de generaciones, tg = tiempo de generación, t= tiempo, K= constante de crecimiento

tg=t*ln(2)/[ln(Nf)-ln(No )] ln(Nf)=ln(No ) + [ln(2)/tg ]*t tg=t*ln(2)/[ln(Nf)-ln(No )]

K=3,32*[log(Nf )-log(No )]/(tf – to ) K=1/tg K=3,32*[log(Nf )-log(No )]/(tf – to )

Bajo condiciones dadas de crecimiento (medio, temperatura, pH, etc) cada especie bacteriana tiene un tiempo de generación determinado genéticamente Los tiempos de generación varían ampliamente El más corto conocido es de alrededor de 6 min/generación. Algunas bacterias tienen tiempos de generación de horas, días, semanas, meses.

VARIACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR Donde: Variación de la concentración celular en el tiempo, N: Concentración celular en tiempo (t), µ: Velocidad específica de crecimiento (t-1 ) Integrando N=No expµt

ln(N)=ln(No ) + [ln(2)/tg ]*t N=No expµt Linealizando ln(N)=ln(No ) + µ*t ln(N)=ln(No ) + [ln(2)/tg ]*t µ= [ln(2)/tg ]

CONSUMO DE SUSTRATO Prolongar la fase log Medio fresco

(dN/dt)=YS (-dS/dt) YS =(dN/-dS) YS =(Nf – No )/(Sf – So ) A medida que aumenta la concentración celular, la concentración de sustrato disminuye. (dN/dt)=YS (-dS/dt) Donde: dN/dt: Variación de la concentración celular en el tiempo, dS/dt: Variación en la concentración de sustrato en el tiempo, -YS : es el rendimiento de utilización de sustrato. YS =(dN/-dS) YS =(Nf – No )/(Sf – So )

(1/N)*(dN/dt)=YS *(-dS/dt)*(1/N) Dividiendo por 1/N (1/N)*(dN/dt)=YS *(-dS/dt)*(1/N) qs =(-dS/dt)(1/N) µ=YS qs µ=(1/N)*(dN/dt) Donde qs es la velocidad específica instantánea de consumo de sustrato por el microorganismo en un intervalo de tiempo

µ=YS qs Hay una compensación entre la tasa de consumo de sustrato y el rendimiento de forma que los microorganismos que tienen altas tasas de consumo de sustrato tienen rendimientos mas bajos y viceversa.

Crecimiento celular con sustratos múltiples -Opcion A: consumo simultáneo -Opcion B: crecimiento diaúxico

Velocidad de crecimiento = velocidad de muerte ETAPA ESTACIONARIA Elevada concentración de biomasa Escasez de sustrato Crecimiento lento Sustrato usado básicamente para mantenimiento Velocidad de crecimiento = velocidad de muerte (dN/dt)=0 CRECIMIENTO CRÍPTICO

Expresión cinética del proceso de mantenimiento (dS/dt)=-ms N Donde: mS: coeficiente cinético de mantenimiento celular, kgS/(kgN*h)

ETAPA DE MUERTE O LISIS CELULAR Expresión cinética del proceso de muerte celular (dN/dt)=-Kd N Muerte significa la pérdida irreversible de la capacidad para reproducirse (crecer y dividirse). Designar a una célula microbiana como muerta no implica su inactividad metabólica.

PROBLEMA Un fermentador de 10 litros de medio es inoculado con 500 ml de inóculo de 4,1 g/l. Se sabe que si se deja crecer la cepa, al cabo de 6 horas la biomasa en el fermentador será de 6 g/l. Determinar el tiempo de duplicación y el tiempo que deberá permanecer la cepa en el fermentador para alcanzar la misma concentración del inóculo.

RELACIÓN ENTRE LA VELOCIDAD ESPECÍFICA DE CRECIMIENTO Y LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO En condiciones de sustrato abundante y ausencia de inhibición, la concentración de sustrato no afecta el valor de µ. Pero cuando el sustrato se hace limitante, si hay un efecto.

ECUACIÓN DE MONOD μmax: velocidad específica de crecimiento máxima, (t-1 ) KS: constante de semisaturación, (g de S/l)

OTRAS ECUACIONES Donde “n” es una constante empírica que se obtiene por ajuste de datos experimentales

INHIBICIÓN DE CRECIMIENTO Es la disminución de la actividad de los microorganismos, retardo e impedimento de su desarrollo, y por lo tanto, de la fermentación. La fermentación pone lenta e incluso se para, principalmente por: Agotamiento de algún elemento necesario (oxigeno, sustancias nitrogenadas,.....) - Formación o presencia de sustancias inhibidoras (alcohol, CO2, ciertos sustratos…)

INHIBICIÓN Donde “KIS” es la constante de inhibición por sustrato

INHIBICIÓN Por producto: Donde “KIP” es la constante de inhibición por producto y P es la concentración de producto

DATOS DE UNA FERMENTACIÓN

ANÁLISIS DE CURVAS DE CRECIMIENTO: APLICACIONES Objetivo: obligar a un microorganismo a crecer usando arsénico en lugar de fosfato para sus biomoléculas. Fuente del microorganismo: Fango del lago Mono en California, un lago hipersalino con altas concentraciones de arsénico

El fósforo es un bioelemento esencial El fósforo es un bioelemento esencial. Los seres vivos lo usan para hacer ATP que usan como moneda energética en el metabolismo. Pero también se usa para hacer unas cuantas biomoléculas, principalmente los ácidos nucleicos y los fosfolípidos.  Parece que el arsénico puede sustituir al fósforo en los ácidos nucleicos. El parecido en la reactividad química es lo que explica la toxicidad del arsénico. Se incorpora en las rutas metabólicas del fósforo sustituyéndolo en la formación de enlaces ésteres. Pero a diferencia del fósforo, las biomoléculas que llevan arsénico en su composición son mucho menos estables. Análisis Nano-SIMS de células de GFAJ-1 creciendo con arseniato (imágenes B, D y F) o con fosfato (imágenes C, E y G). SIMS son las siglas en ingles de Secondary ion mass spectrometry y lo que nos dice esta técnica es la composición elemental de las células. A mayor color, más cantidad del elemento (As o P) que se está midiendo.

Curvas de crecimiento de GFAJ-1 en diferentes condiciones de cultivo Curvas de crecimiento de GFAJ-1 en diferentes condiciones de cultivo. En A se representa la densidad óptica y en B el número de células de los cultivos en presencia de fosfato (línea contínua y círculos negros), arsenato (línea discontinua y cuadrados negros) y sin fosfato ni arsenato (línea continua y triángulos blancos).

CONCLUSIONES Halomonadaceae crece con un tiempo de generación de 31 horas en presencia de arsénico y sin fosfato. Si se crece en un medio con fosfato (1,5 mM) y sin arsénico, el microorganismo crece entonces con un tiempo de generación de 19 horas y se obtienen 10 veces más células en fase estacionaria. Si no hay ni fosfato ni arsenato en el medio, el microorganismo no crece.

CONSUMO DE SUSTRATOS

Caso A Caso B Caso C

¿Qué nombre recibe este tipo de crecimiento con dos sustratos? Calcule los tiempos de generación para dada uno de los sustratos en cada uno de los casos. Cómo afecta la concentración inicial de sustrato a: rendimiento sustrato-biomasa, tiempo de generación global, tiempo total de fermentación y concentración final de biomasa. Si se desea hacer una fermentación con un solo sustrato, ¿Cuál elige?

FERMENTACIONES FED-BATCH Glicerol puro Glicerol crudo Comparación productividades PHB

Influencia del oxígeno en la producción de biomasa

FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA CONDICIÓN 1 T= 28°C [ ] = 16°brix Tiempo = 24 h CONDICIÓN 2 T= 38°C [ ] = 20°brix Tiempo = 24 h