MEDIOS DE CULTIVOS Los componentes de los medios de cultivo son de naturaleza química, desempeñan un rol esencial en los procesos porque requerimientos del crecimiento formación de productos suministrar energía para la síntesis de metabolitos y mantenimiento celular. CAROLINA VITA

Diseño y optimización de medios de cultivo Optimización de la expresión celular: Producción de algún producto Aumento de producción de biomasa Mejorar la velocidad o rendimiento de algún producto

Efectores que intervienen en el crecimiento y formación de productos Efectores intracelulares : información genética que posee el MO. Puede ser modificada por el agregado o extracción de genes. Efectores extracelulares son los factores del entorno que pueden modificar la expresión: físicos y químicos

Efectores extracelulares Fisicoquímicos Efectores extracelulares Fisicoquímicos Relacionados con las características del sistema de cultivo pH presión osmótica estado redox parámetros físicos como T y P Agitación Aeración formación de espuma nutrientes del medio de cultivo

Categorias de nutrientes Macronutrientes [ g/l ] Representados por: fuentes de C, N, S, P, K y Mg; Micronutrientes o elementos trazas [mg/l o µg/l] Representados por: sales de Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co Factores de crecimiento componentes orgánicos suministrados en [] no son sintetizados ni metabolizados por las células, son incorporados a estructuras celulares y de función metabólica específica, como vitaminas, aa, ácidos grasos no saturados, etc..

Clasificacion de medios Por naturaleza química de los componentes, medios sintéticos o medios químicamente definidos medios complejos en cuya composición son sustancias de origen animal o vegetal como peptonas, extracto de levadura, macerado de maíz, harina de soja, etc. químicamente indefinidas y de composición variable.

Diseño Finalidad: elección de los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formación de productos Debe tener en cuenta: los requerimientos nutricionales del MO la disponibilidad real de los componentes

Requerimientos nutricionales Los requerimientos nutricionales están determinados por el tipo de metabolismo celular Autotrófico: MO que obtienen el carbono del C02 (algas y algunas bacterias) heterotróficos: necesitan compuestos orgánicos como fuente de carbono Otro factor esencial es el 02( aerobico o anaerobico) Las fuentes de carbono cumplen también el rol de ser fuente de energía.

Requerimientos nutricionales Fuentes de nitrógeno De naturaleza inorgánica u orgánica. Es utilizado para la biosíntesis de proteínas, ácidos nucleicos y polímeros de la pared celular.

Requerimientos nutricionales otros macronutrientes como el P y el S son suministradosen forma de P04 H y S04 (o aminoácidos azufrados). El P se incorpora en ácidos nucleicos, y polímeros celulares. El S es asimilado para la síntesis de aa azufrados, y además se necesita para la biotina, coenzima A, tiamina y otros componentes.

Requerimientos nutricionales K y Mg son esenciales Una parte importante del K está unida al RNA El ión K actua como coenzima y probablemente actúa como catión en la estructura aniónica de varios componentes celulares. El ión Mg es esencial para la estabilidad de los ribosomas y actua como cofactor en numerosas reacciones del metabolismo. K y Mg se incorporan como sales de fosfato y sulfato.

Requerimientos nutricionales los micronutrientes se distinguen 2 categorías frecuentemente esenciales para el crecimiento como Ca, Mn, Fe, Co, Cu y Zn y b) raramente esenciales como B, Na, Al, Si, Cl, V, Cr, Ni, As, Se, Mo, Sn, e I. A veces es difícil demostrar un requerimiento de un micronutriente porque generalmente está presente en suficiente cantidad como impureza de los componentes principales.

Disponibilidad de los componentes Los nutrientes además de estar presentes en el medio de de cultivo, deben estar disueltos para estar disponibles para ser usados por la célula. ¿POR QUÉ PUEDEN NO ESTAR DISPONIBLES? la esterilización por calor. Se debe tener en cuenta la T, tiempo de calentamiento, pH del medio reacciones entre componentes antes, durante o después de la esterilización

Disponibilidad de los componentes Es importante tener en cuenta la naturaleza de los compuestos orgánicos que tienen capacidad para actuar como ligandos, y el ion metálico considerado Importante: [ ] libre del ión

Modificación de la calidad nutricional de un medio de cultivo durante la esterilización Los cambios que se producen durante la esterilización pueden ser importantes A veces puede haber modificaciones beneficiosas o perjudiciales dependiendo del tiempo de esterilización.

Modificación de la calidad nutricional del medio por la esterilización Los aa y factores de crecimiento son muy lábiles al calor. puede sufrir descomposición.  se recomienda esterilizarlas por filtración. Las sales de NH4 + se deben autoclavar a pH 7 o menor  se volatiliza. La esterilizacion por calor depende también de la T, duración del calentamiento, pH del medio, y de la agitación.

Los PO4 deben esterilizarse separadamente Los HPO4 utilizados como fuente de P y buffer deben esterilizarse separados de las sales de Mg, con Na, K y NH4 NaMgPO4 NH4MgPO4 poseen baja solubilidad KMgPO4 Los PO4 deben esterilizarse separadamente de las sales de Mg y NH4

Los azúcares pueden descomponerse por la acción del calor en presencia de sales inorgánicas y compuestos amínicos. sales, H+ sacarosa hidroliza Los grupos carbonilos de los azúcares con los grupos amino de las proteínas, aminoácidos, etc., dan productos de condensación (reacción de Maillard), los cuales disminuyen significativamente las cantidades de carbohidratos y N amínico disponible. azúcares reductores + -NH2 condensación Los carbohidratos se deben esterilizar por separado de los compuestos nitrogenados orgánicos.

Disponibilidad de los nutrientes Es aconsejable entonces, esterilizar los componentes de los medios de cultivo en fracciones separadas: Fracción 1: Fte. de C, micronutrientes, sales de Mg, Ca, etc. Fracción 2: Fte. de N en caso que se descomponga por calor (urea) debe esterilizarse por filtración, o en caso de que reaccione con la fuente de C puede esterilizarse por calor pero separadamente. Fracción 3: Vitaminas y factores de crecimiento. Se preparan soluciones 1000 veces mas concentradas y se esterilizan por filtración. Fracción 4: Fosfatos, se esterilizan por calor.

Materias primas fundamentales Los componentes empleados en la industrias: costo disponibilidad estabilidad en su composición química el costo de los nutrientes representa entre al 10 y el 60% del costo total de mucho productos obtenidos por fermentación

Materias primas fundamentales Las fuentes de carbono pueden Hidratos de carbono como glucosa o dextrosa, sacarosa, lactosa, almidón, dextrina; Alcoholes como el glicerol y manitol Hidrocarburos como hexadecano, octadecano y otros.

Materias primas fundamentales Las fuentes de nitrógeno Inorgánica: amoníaco o sales de amonio. Las orgánicas están representadas por varios productos, como ser: Hidrolizados de proteínas (Peptonas) que son obtenidas por hidrólisis ácida o enzimática de distintas fuentes proteicas como carne de animales, pescado, caseína, gelatina, harina de soja, algodón, girasol,etc..

Materias primas fundamentales Extracto de carne, que se obtiene por extracción acuosa y concentración posterior Extracto de levadura, que puede ser obtenida mediante autólisis o plasmólisis de la levadura, Extracto de malta, que es el extracto soluble en H2O de la malta de la cebada "Cornsteep", el agua de maceración de la industria del maíz se utiliza como componente esencial de los medios para la producción de antibióticos y enzimas.

Diseño, Formulación, Optimización de medios de cultivo Diseño: Elección de los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formación de productos Formulación: Proporciones, concentraciones de cada componente. Optimización: Encontrar la mejor formulación para lograr el objetivo (máx biomasa, producto, etc.)

Formulación La formulación tiene que ver con los aspectos cuantitativos de los medios establecer las concentraciones de cada componente a ser utilizadas.

Optimización Pueden ocurrir situaciones en las cuales sea imperativo la optimización de los medios de cultivo. Podemos mencionar las siguientes: Existencia de limitaciones nutricionales ocultas (microelementos y factores de crecimiento) Uso de medios con exceso respecto de los requerimientos nutricionales del mo que pueden causar inhibición del crecimiento. Ensayo de sustancias estimulantes, activadoras e inhibidoras del crecimiento y formación del producto. Empleo de fuentes nutricionales no convencionales.

Optimización La metodología más elemental consiste en realizar experimentos, en los cuales se varía la [] del componente a ensayar manteniéndose constante las [] de los demás. Para organismos aerobios generalmente se utiliza como sistema de cultivo erlenmeyers agitados. se analiza el efecto de la variable escogida sobre la velocidad de crecimiento y la [] de biomasa obtenida.