Análisis de la expresión de marcadores moleculares en adenopatías mediastínicas de pacientes con Cáncer de Pulmón no microcítico con resección completa: una aproximación a la estadificación molecular S. Benlloch (1), JM Galbis (2)*, A.Teruel (3), S.Bolufer (2), José Ponce (4), I.Aranda (3), J. Cerezal (2), R. Rosell (4)**, M. Tarón (1), B.Massutí (4). Unidad Investigación (1), Cirugía Torácica (2), Anatomía Patológica (3), Oncología Médica (4), Hospital General Universitario de Alicante, Alicante, *Hospital de la Ribera, Alzira, **Institut Català d´Oncologia, Badalona bmassutis@seom.org

Fundamentos La supervivencia a 5 años del Cáncer de Pulmón no Microcítico con resección quirúrgica completa se sitúa entre 60-70% Cuando existe afectación neoplásica ganglionar la supervivencia es inferior al 50% La extensión ganglionar es el principal factor clínico predictivo para recidiva y pronóstico para peor supervivencia

Antecedentes Los estudios histopatológicos actuales muestran limitaciones en la estadificación ganglionar: Análisis sistematizado exhaustivo Técnicas inmunohistoquímicas El incremento de sensibilidad en la detección de la extensión ganglionar de las neoplasias broncopulmonares podrían suponer un avance: Selección de pacientes de alto riesgo Proceso de indicación de tratamiento quimioterápico postoperatoria

Objetivos Valorar la factibilidad de detectar células neoplásicas en las adenopatías regionales mediante una aproximación de análisis molecular Evaluar diversos biomarcadores potenciales Correlacionar los hallazgos con los estudios histopatológicos e inmunohistoquímicos Analizar su potencial impacto pronóstico en el curso evolutivo de los pacientes

Métodos Pacientes elegibles: pacientes con Cáncer de Pulmón no Microcítico con resección R0 y Estadio I patológico (cirugía con linfadenectomía mediastínica sistemática) Las piezas quirúrgicas (pulmón y adenopatías) fueron evaluadas de manera protocolizada por anatómo-patólogo realizándose una disección ganglionar sistemática Se recogieron muestras pareadas de tumor y de cada uno de los ganglios linfáticos y se dividieron en 2 portas (fijación y bloque parafina / congelación a 80º C)

Métodos/2 Estudio histopatológico protocolizado: clasificación, grado histológico, estadificación patológica. Se examinaron un mínimo de 3 secciones no consecutivas con tinción HE en cada ganglio linfático Análisis IHQ para CK7 (Clone COU-TL12/30, Dako, 1:50) Identificación y validación de potenciales marcadores moleculares: SAGE (http://cgap.nci.nihl.gov/Catalog)

SAGE Anatomic Viewer. Ejemplo expresión diferencial PLUNC

Métodos/3 Anális de la expresión de mRNA de 13 genes: CEACAM5, CDX1, CK19, CK20, EVA1, Efrina A1, Mesotelina, MGB2, MAGE A10, PLUNC, SFTPC, E-Cadherin, TACSTD2 RT-Q-PCR usando ABIPRISM 7500 Extracción RNA mediante ABIPRISM 6100 Specific designed Primers y sondas diseñadas específicamente (Applied Biosystems assay-on-demand) Todas las determinaciones se realizaron por triplicado GADPH como control

GAPDH CEA, PLUNC CEA, PLUNC CEA, PLUNC

Pacientes 38 pacientes consecutivos con CPCNP con resección completa y estadio patoológico I Mediana seguimiento 24 meses (9-46 m) 11 p fallecen por CPCNP y 1 p fallecido sin recidiva 28 hombres / 10 mujeres Mediana edad 66 a (44-79) Subtipos histológicos: 12 adenoca / 16 epidermoides / 10 indif. célula grande Tipo cirugía: 34 lobectomía 4 neumonectomía

Resultados Entre los genes estudiados CEA and PLUNC mostraron alta expresión in tejido pulmonar y baja o nula expresión en ganglios linfáticos normales Se consideran adenopatías con positividad molecular aquellas en las que la expresión de CEA o PLUNC se detectó por triplicado en la RT-Q-PCR 96

Resultados/2 344 muestras ganglionares con negatividad histopatológica (pN0) 44/344 + para CEA (13%) 54/344 + para PLUNC (16%) Patrón de expresión similar para ambos marcadores 24/38 pacientes (63%) mol + N1 8/38 pacientes (21%) mol + N2

Resultados/3: Parámetros clínico-moleculares Mol Negat N2 Mol Posit N2 p Sexo Hombre Mujer 23 (79%) 7 (78%) 6 (21%) 2 (22%) 0.99 Tamaño T <3 cm >3 cm 16 (89%) 14(70%) 2 (11%) 6 (30%) 0.24 Estadio IA IB 8 (90%) 31 (75%) 1 (10%) 7 (25%) 0.65 Localización tumor LSD LSI LID+LMD LII 10 (91%) 12 (86%) 3 (37%) 4 (100%) 1 (9%) 2 (14%) 5 (63%) 0.02

Resultados/4: Parámetros clínico-moleculares Mol Negat N2 Mol Posit N2 p Infiltración pleural Sí No 16 (80%) 14 (78%) 4 (20%) 4 (22%) 0.99 Histología Epidermoide Adenoca Célula Grande 11 (79%) 8 (80%) 3 (21%) 2 (20%) Adenop. Mol N1 Negat Posit 14 (100%) 16 (67%) 8 (33%) 0.02

Resultados/5: Adenopatias Mediastinicas Mol Positivas y evolución Mol Negat p Mediana SLE (meses) 15 +/- 11.74 m NR 0.028 Mediana Superv. 17.3 +/- 5.7 0.0083

Resultados/6: análisis multivariante para SLE HR (95% C.I.) p Mol N2 status Negativo Positivo 30 8 1 Ref 2.54 (0.69-9.27) 0.16 Tamaño T < 3 cm > 3 cm 18 20 4.29 (0.79-23.3) 0.09 Infiltración pleural Sí No 4.02 (0.69-23.29) Ref 1 0.12 Histología Epidermoide Adenoca Cél. Grande 14 10 4.11 (0.56-29.97) 4.59 (0.86-24.39) 0.07 Sexo Hombre Mujer 29 9 2.07 (0.28-15.49) 0.48 Edad 38 1.04 (0.96-1.13) 0.33

Resultados/7: análisis multivariante superv. HR (95% C.I.) p Mol N2 status Negativo Positivo 30 8 1 Ref 6.14 (1.49-25.34) 0.01 Tamaño T < 3 cm > 3 cm 18 20 5.18 (0.67-40.17) 0.12 Infiltración pleural Sí No 8.63 (0.99-75.16) Ref 1 0.05 Histología Epidermoide Adenoca Cel. Grande 14 10 7.70 (0.80-74.28) 9.59 (1.50-61.55) 0.08 0.02 Sexo Hombre Mujer 29 9 2.63(0.28-24.53) 0.40 Edad 38 1.08 (0.99-1.18) 0.06

Conclusiones La expresión de mRNA de CEA y PLUNC podría ser utilizada como marcador molecular de micrometástasis ocultas en los ganglios linfáticos de los pacientes con CPCNP 63% de los pacientes pN0 podrían ser clasificados como N1 molecular 21% de los pacientes pN0 podrían ser clasificados como N2 molecular La expresion de mRNA de CEA y PLUNC en las adenopatías mediastínicas muestra un impacto pronóstico en la supervivencia de los pacientes resecados en Estadio I La expresión de CEA y PLUNC puede ser una herramienta de selección para pacientes en Estadio I con alto riesgo y podría ser útil en la indicación de tratamiento quimioterápico adyuvante en este subgrupo de pacientes

Agradecimientos A Susana Benlloch A María Sánchez-Ronco por el análisis estadístico Al personal de enfermería y auxiliar de quirófano A los técnicos de laboratorio A las data managers Financiación: Convocatoria 2006 Dirección General de Ordenación, Evaluación e Investigación Sanitaria de la Generalitat Valenciana