ANALISIS NUTRICIONAL DE ALIMENTOS Dra. Diana Chalco Quezada CROMATOGRAFIA ANALISIS NUTRICIONAL DE ALIMENTOS Dra. Diana Chalco Quezada

INTRODUCCION En 1910 el botánico ruso M. Tswett describió por primera vez esta técnica, que se aplicó a la separación de pigmentos de plantas, dándole el nombre de cromatografía en referencia a las bandas coloreadas de pigmentos que se separaban por su adsorción selectiva sobre columnas de yeso. Se redescubrió en 1930 por Lederer y Kuhn, quienes la aplicaron para la separación de carotenoides. A partir de allí, se fue extendiendo el uso de esta técnica, desarrollándose diferentes versiones de la misma.

DEFINICION Método físico de separación, en el que los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una inmóvil (fase estacionaria) y otra móvil (fase móvil) la cual se desplaza a través de la primera. Sirve para la determinación e identificación de los componentes químicos de mezclas complejas. Ningún otro método es tan poderoso ni tiene tantas aplicaciones como la cromatografía.

DEFINICION Los componentes de una mezcla pasan a través de una fase estacionaria mediante el flujo de una fase móvil y las separaciones están basadas en las diferencias en la velocidad de migración entre los componentes de la fase móvil.

APLICACION No existen restricciones sobre la naturaleza de las fases a utilizar siempre que la fase estacionaria sea sólida o líquida, y la fase móvil líquida o gaseosa. La dificultad está en la elección de las condiciones óptimas de separación, lo que en muchas ocasiones implica la irreproducibilidad de los resultados. Por ello no es una técnica de rutina que pueda aplicarse a cualquier mezcla, sin invertir gran cantidad de esfuerzo y tiempo.

TERMINOLOGIA Eluyente: componente que se emplea para acarrear los componentes de una mezcla a través de una fase estacionaria. Cromatograma: es el grafico de concentración del soluto contra el tiempo o volumen de elución. Tiempo muerto: es el tiempo requerido para que una especie no retenida pase a través de la columna. Tiempo de retención: es el tiempo entre la inyección de la muestra y la aparición del pico de un soluto en el detector. Elución: se limpian los solutos a través de una fase estacionaria por el movimiento de una fase móvil.

TIPOS DE CROMATOGRAFIA Por la naturaleza de sus fases: Cromatografía líquido - líquido Cromatografía gas - líquido Cromatografía líquido - sólido Cromatografía gas - sólido

TIPOS DE CROMATOGRAFIA Atendiendo al proceso químico-físico que va a protagonizar el proceso de separación: este el criterio más coherente de clasificación): Cromatografía de Adsorción (líquido - sólido o cromatografía de fases normales). (capa fina) Cromatografía de Reparto (o líquido - líquido), se basa en las características de solubilidad relativa de los solutos entre la fase móvil y una fase estacionaria de un líquido no polar. La fase líquida se impregna a un soporte inerte de sílice o, en el caso de cromatografía de fase invertida, se une químicamente. (cromatog.de papel) Cromatografía de Intercambio iónico. Cromatografía de Exclusión.

TIPOS DE CROMATOGRAFIA Con base en la naturaleza del soporte en el que se aloja la fase estacionaria: CROMATOGRAFÍA PLANA: - Cromatografía en papel - Cromatografía en capa fina (TLC) CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA: - Cromatografía de gases (GC) - Cromatografía líquida (LC) - cromatografía líquido - líquido - cromatografía sólido – líquido

ADSORBENTES MAS COMUNES Celulosa Sulfato cálcico (yeso) Sílice Florisil Oxido de magnesio Alúmina Carbón activo

DISOLVENTES MAS COMUNES Eter de petróleo Ciclohexano Benceno Tetracloruro de carbono Diclorometano Cloroformo Eter dietílico Acetato de etilo Acetona N- propanol Etanol Metanol Agua Acido acético

COMPONENTES DEL SISTEMA CROMATOGRAFICO Fase estacionaria (sólido, líquido, polar, apolar, etc.) Fase móvil (sólido, líquido, gas, composición, flujo) Soporte ( Placa de vidrio, plástico, aluminio; Tubo de vidrio; HPLC: Tubo de acero inoxidable Inerte • Revelador (Universal: yodo, HPLC detector I. Refracción; Específico: luz UV 254 nm, HPLC: Detector UV-Vis var., fluorómetro.

CROMATOGRAFIA PLANA: CROMATOGRAFIA EN PAPEL En este caso, el soporte y fase estacionaria es papel. El papel que normalmente se utiliza es de celulosa. La celulosa es muy polar en el agua y se vuelve electronegativa. El papel tiene propiedades de intercambio iónico débiles, así como de adsorción.

CROMATOGRAFIA EN PAPEL La mayoría de las propiedades varían de papel a papel, lo que provoca variaciones en el Rf. Actualmente existen papeles modificados con resinas cambiadores de iones, alúmina, etc. El aparato que se usa consta de un soporte para el papel, un recipiente para el disolvente y una cámara hermética para desarrollar el cromatograma. La cámara hermética es necesaria para evitar la evaporación de los disolventes volátiles debido a la gran superficie del papel expuesta. Antes de sumergir el papel en el disolvente de elución se aplica la muestra en forma de punto diminuto con cualquier objeto que pueda transferir un pequeño volumen.

CROMATOGRAFIA EN PAPEL

CROMATOGRAFIA PLANA: CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA TLC Para la cromatografía en capa fina (TLC), la fase estacionaria es una capa de partículas de unos milímetros de espesor, fijadas sobre un soporte sólido generalmente de aluminio, plástico o vidrio. Después de aplicar el analito cerca de la parte inferior de la placa seca, el disolvente empieza a producir la separación. La ventaja principal de la TLC es que se analizan simultáneamente la muestra y el patrón, mientras que en la cromatografía en columna las muestras se analizan individualmente.

CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA - TLC La detección y localización de las manchas en la placa de TLC se hace observando los cambios en la fluorescencia, o absorción en el U.V., de un indicador que se incorporó a la fase estacionaria. La mancha en una placa de TLC se caracteriza por la distancia que recorre con relación a la distancia recorrida por la fase móvil. El grado de retención en cromatografía plana de superficie se expresa como el factor de retardación, o índice de retención Rf:

CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA

CROMATOGRAFIA PLANA El flujo de la fase móvil puede conseguirse de dos formas: 1) por capilaridad (cromatografía horizontal y ascendente) y 2) por capilaridad y gravedad (cromatografía descendente). En la cromatografía plana queda eliminada el uso de un gas como fase móvil, por lo que ésta siempre es líquida.

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO La separación en la cromatografía de intercambio iónico depende la adsorción reversible de moléculas de soluto cargadas, a una resina con grupos iónicos de carga opuesta. El mecanismo de separación se basa en un equilibrio de intercambio iónico.

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO

CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION El sólido es un gel formado por polímeros no iónicos porosos que retienen a las moléculas de soluto según su tamaño.

CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD Es un tipo de cromatografía de adsorción, utilizado en bioquímica, en la que un sólido tiene un llamado ligando de afinidad, que puede ser un indicador enzimático o un anticuerpo.

CROMATOGRAFIA EN COLUMNA Se utiliza un tubo cilíndrico, en cuyo interior se coloca la fase estacionaria y a su través se hace pasar la fase móvil. El flujo de la fase móvil (líquido o gas) a través de la estacionaria se consigue: 1) por presión, 2) por capilaridad, 3) por gravedad. Es necesario aclarar que la cromatografía de gases solo puede realizarse en columna.

CROMATOGRAFIA EN COLUMNA El aislamiento de las especies separadas se logra pasando una cantidad suficiente de la fase móvil a través de la columna para hacer que las bandas individuales salgan hacia el extremo(al ser fluidas de la columna) donde se puede recolectar o detectar.

En la cromatografía plana la separación se realiza por distancias mientras que en columna se hace por tiempos o volúmenes. En general, los solutos mas retenidos en cromatografía plana forman manchas compactas, por lo que se detectan con mayor sensibilidad. Por el contrario, los solutos mas retenidos en la columna son los que dan picos más anchos menos resueltos y sensibles

CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION HPLC Capaz de separar macromoléculas y especies iónicas, productos naturales lábiles, materiales poliméricos, grupos funcionales de alto peso molecular.

CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION (HPLC) Las reglas básicas en HPLC son cuatro: 1. Fase móvil y estacionaria han de ser de polaridad opuesta. 2. Todos los solutos han de ser solubles en la fase móvil (es decir, polaridad similar). 3. Todo soluto que entra en la columna ha de salir de ella (propagación). 4. Y, a ser posible, con los distintos solutos separados (migración diferencial).

INTRUMENTACION GENERAL Un cromatógrafo de líquidos consta de módulos con funciones bien definidas. Son: Sistema de suministro de fase móvil Sistema de inyección Detector continuo Otros elementos adicionales

HPLC: SISTEMA DE SUMINISTRO DE FASE MOVIL Es un sistema de bombeo de fase móvil de alta presión para forzar el paso de la fase móvil a través de la columna, cuyo relleno muy compacto, es responsable de una importante sobrepresión.

SISTEMA DE SUMINISTRO DE FASE MOVIL: BOMBA Su misión es suministrar un caudal constante de la fase móvil a través de la columna. Un sistema de bombeo debe cumplir con las siguientes características: Estar construido con materiales químicamente inertes frente a la fase móvil. Ser capaz de trabajar a presiones elevadas. Proporcionar un flujo libre de pulsaciones, ya que de lo contrario pueden contribuir al ruido y disminuir la sensibilidad, aunque no afecta a la separación en sí. Suministrar un caudal constante a lo largo del tiempo, ya que de él depende la reproducibilidad de los tiempos de retención.

SISTEMAS DE MEZCLA DE FASE MOVIL ISOCRATICO: cuando la fase móvil mantiene la misma composición durante la elución. EN GRADIENTE: cuando la composición de la fase móvil cambia según una función dependiente del tiempo.

HPLC: SISTEMA DE INYECCION DE MUESTRA La inyección de un volumen preciso de muestra debe hacerse a la entrada de la columna en un corto período de tiempo para perturbar lo menos posible el régimen de circulación de fase móvil establecido en la columna y el detector. Los volúmenes son pequeños (pocos microlitros).

SISTEMAS DE INYECCION El método de introducción de la muestra es de suma importancia, pues un mal sistema de inyección puede dar lugar a ensanchamientos de la banda cromatográfica que deterioren la eficacia del sistema cromatográfico. Un inyector ideal debe: Introducir la muestra en la columna como una banda lo más estrecha posible. Ser de fácil manejo Resultados reproducibles tanto en la cantidad de muestra inyectada como en el ensanchamiento de la banda cromatográfica. Trabajar a presiones elevadas.

TIPOS DE INYECTORES Inyectores de jeringa: La introducción de la muestra se realiza por medio de una jeringa cuya aguja entra en el sistema cromatográfico a través de un membrana (septum) lo que permite depositar la muestra en la cabeza de l columna. Inyectores de válvula: es la mas usada. Es una válvula de seis vías, dos de las cuales están conectadas entre sí por medio de una espira, la cual es un tubo de volumen conocido, cuya misión es la de contener la muestra antes de efectuarse la inyección. La inyección se lleva a cabo en dos etapas: la primera se realiza a presión atmosférica y se carga la muestra en la espira con ayuda de una jeringa; en la segunda girando la válvula se hace pasar el eluyente a través de la espira hacia la columna.

CONDUCCIONES Y CONEXIONES Son de gran importancia entre inyector y columna y entre columna y detector. El tubo de conducción debe ser de diámetro interno pequeño(capilares) y evitar el uso de tubos de conexión de grandes longitudes. De este modo se consigue reducir los volúmenes muertos del sistema, que causan una pérdida de eficacia. Deben ser inertes frente a la fase móvil y a las sustancias a separar. Se usan de acero inoxidable o titanio.

HPLC: COLUMNA CROMATOGRAFICA Son tubos rectos de acero que miden entre 3-30 cm de longitud, su diámetro es de 2-60 mm. Actualmente se encuentran entre 0.5-2 mm y longitud de 25-100 cm. Como relleno se puede utilizar un relleno pelicular (partículas pequeñas de sílice o alumina) o partículas porosas (partículas más grandes). Muchas veces para alargar la vida de la columna analítica se utilizan precolumnas con el objeto de retener impurezas de la muestra que podrían perjudicar la columna cromatográfica. El relleno de la precolumna es similar al de la columna pero con mayor tamaño de partícula.

COLUMNA CROMATOGRAFICA Es el elemento fundamental del sistema cromatográfico, pues en ella tiene lugar la separación. Resulta fundamental una correcta elección de la columna adecuada para cada separación. Las columnas más utilizadas son las de relleno En la actualidad hay columnas capilares en las que se usan tubos de 200-500 um de diámetro y de gran longitud (varios metros), en las cuales la fase estacionaria se encuentra ligada químicamente a las paredes del tubo, por lo que se innecesario la utilización de partículas de fase estacionaria.

COLUMNA CROMATOGRAFICA Las características que influyen sobre la capacidad de separación son: Diámetro interno Longitud Conexiones Relleno Tamaño de partículas de relleno.

PRECOLUMNAS Para aumentar la vida y prestaciones de la columna analítica o preparativa, se recomienda que se protejan de la contaminación proveniente de la muestra, del solvente o de la matriz.

HPLC: DETECTOR Debe ser sensible a pequeñas concentraciones de analito, dar una respuesta lineal amplia, tener poco ruido de fondo, y ser estable en el tiempo que dura el cromatograma. Permite medir a la salida de la columna, una propiedad física del eluyente. La detección se realiza en contínuo.

DETECTORES Se pueden dividir los detectores en dos grandes grupos: Los que aportan información estructural sobre las sustancias eluídas (permiten la obtención de espectros de las sustancias que salen de la columna) y aquellos que no la aportan (son los más usados). Entre los del segundo grupo tenemos: detector de índice de refracción, de ultravioleta y/o visible, de fluorescencia, de conductividad eléctrica, electroquímico.

HPLC La elución de los componentes de una muestra comprende el lavado de una parte de la muestra disuelta en la fase móvil a través de una columna de fase estacionaria por agregado de disolvente fresco. La porción de muestra se introduce por la parte superior de la columna (tiempo t0), los componentes se distribuyen por sí mismos entre las dos fases según la naturaleza química de éstos con respecto a las fases móvil y estacionaria. Adiciones posteriores del disolvente llevan a las moléculas de soluto hacia abajo en la columna, hasta que salen de ella en una tiempo determinado.

HPLC La velocidad a la cual un soluto migra depende de la fracción de tiempo que ha necesitado para salir de la columna, tiempo que es detectado por un detector. Esta velocidad será pequeña para solutos fuertemente retenidos por la fase estacionaria, y será grande para solutos que tengan mayor afinidad por la fase móvil.

HPLC El detector se coloca en el extremo final de la columna, y la señal se transforma en una gráfica en función del tiempo denominada cromatograma. El cromatograma discurre horizontalmente paralelo a la escala de tiempos (línea de base), zona que informa de las condiciones generales del sistema en ausencia de solutos. Luego se observa un brusco incremento sobre la línea base, seguido de un descenso más o menos simétrico que enlaza con la continuación de la misma (pico cromatográfico).

HPLC Idealmente el pico tiene apenas anchura: es estrecho, casi una línea vertical. Pero muchas veces presenta una anchura apreciable, tomando el aspecto habitual de una gaussiana. También se presenta una primera banda peculiar ascendente-descendente (frente del disolvente o frente de inyección), no siempre observable, y que suele hacerse coincidir con el tiempo muerto del sistema o tiempo necesario para que un fluido sin retención atraviese físicamente la columna, tubos, etc. del sistema.

HPLC Las moléculas de un mismo soluto, pese a hallarse sometido a las mismas fuerzas, no eluyen todas al mismo tiempo, sino obedeciendo a un modelo gaussiano. Los picos sobre el eje de los tiempos se emplean para identificar tanto cualitativa (posición en el eje) como cuantitativamente (área bajo los picos) los componentes de la muestra

HPLC La cromatografía cuantitativa se basa en una comparación de la altura o del área del pico de un analito con el de uno o más estándares. Ambos parámetros varían linealmente con la concentración. La cromatografía cualitativa se basa en la comparación de la posición de los picos (tiempos determinados de retención) con cromatogramas estándares.

CROMATOGRAMA

HPLC Los disolventes más utilizados son el agua, el metanol y el acetonitrilo.

CAMPOS DE APLICACION Fármacos: Antibióticos, sedantes esteroides, analgésicos Bioquímica: Aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos Productos de alimentación: Edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos Productos de la industria química: Aromáticos condensados, tensoactivos, propulsores, colorantes Contaminantes: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB Química forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcóticos Medicina clínica: Ácidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina, estrógenos.

CROMATOGRAFIA DE GASES La cromatografía de gases es una técnica cromatográfica en la que la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. La elución se produce por el flujo de una fase móvil de gas inerte. A diferencia de los otros tipos de cromatografía, la fase móvil no interacciona con las moléculas del analito; su única función es la de transportar el analito a través de la columna.

CROMATOGRAFIA DE GASES Existen dos tipos de cromatografía de gases (GC): la cromatografía gas-sólido (GSC) y la cromatografía gas-líquido (GLC), siendo esta última la que se utiliza más ampliamente, y que se puede llamar simplemente cromatografía de gases (GC). En la GSC la fase estacionaria es sólida y la retención de los analitos en ella se produce mediante el proceso de adsorción.

CROMATOGRAFO DE GASES

CROMATOGRAFO DE GASES Un cromatógrafo de gases consta de: sistema de suministro de fase móvil, sistema de inyección de muestra, columna cromatográfica situada en horno termostatizado y detector.

CROMATOGRAFO DE GASES El gas portador debe ser un gas inerte, para prevenir su reacción con el analito o la columna. Generalmente se emplean gases como el helio, argón, nitrógeno, hidrógeno o dióxido de carbono, y la elección de este gas en ocasiones depende del tipo de detector empleado. El almacenaje del gas puede ser en balas normales o empleando un generador, especialmente en el caso del nitrógeno y del hidrógeno. El suministro de gas va asociado con reguladores de presión, manómetros y medidores de flujo.

CROMATOGRAFIA DE GASES Para comprobar el caudal se puede utilizar un rotámetro, el cual da una medida muy exacta del caudal volumétrico que entra a la columna. La inyección de muestra es un paso crítico, ya que se debe inyectar una cantidad adecuada, y debe introducirse de tal forma que sea rápida para evitar el ensanchamiento de las bandas de salida; este efecto se da con cantidades elevadas de analito. El método más utilizado emplea una microjeringa (de capacidades de varios microlitros) para introducir el analito en una cámara de vaporización instantánea. Esta cámara está a 50ºC por encima del punto de ebullición del componente menos volátil, y está sellada por una junta de goma de silicona septa o septum.

CROMATOGRAFIA DE GASES Columna cromatográfica en horno termostatizado: en ella se produce la separación de los analitos. Existen dos tipos de columnas: empaquetadas y capilares. Empaquetadas: rellenas con un soporte sólido de grano muy fino que puede actuar como fase estacionaria. El material debe ser inerte y resistente a elevadas temperaturas. Estas columnas poseen diámetros de 3-6mm y longitud de 1-5 metros.

CROMATOGRAFIA DE GASES Las columnas tubulares o capilares son más estrechas (0.2-0.5 mm) y más largas (10-100m). La pared interior de la columna se recubre con una película de fase estacionaria con un espesor de pocas micras. La cantidad de muestra necesaria es menor. Poseen mucha mejor resolución, mayor sensibilidad y menor tiempo de análisis.

Las fases estacionarias juegan un papel primordial, puesto que la fase móvil es inerte. Las fases estacionarias son en su mayoría líquidas y deben cumplir una serie de requisitos: Baja volatilidad: su temperatura de ebullición debe estar al menos 100 grados por encima de la temperatura máxima de trabajo. Deben ser estables a temperaturas elevadas. Deben ser químicamente inertes. Se deben utilizar fases estacionarias polares para separar compuestos polares; y apolares para compuestos apolares.

CROMATOGRAFIA DE GASES: DETECTORES El detector es la parte del cromatógrafo que se encarga de poner de manifiesto la presencia de solutos o analitos que salen de la columna cromatográfica. Las características de un detector ideal son: Sensibilidad: Es necesario que pueda determinar con precisión cuándo sale analito y cuando sale sólo el gas portador. Respuesta lineal en un intervalo amplio de concentración. Tiempo de respuesta corto Intervalo de temperatura de trabajo amplio, por ejemplo desde temperatura ambiente hasta unos 350-400ºC, temperaturas típicas trabajo.

DETECTORES No debe destruir la muestra. Estabilidad y reproducibilidad, es decir, a cantidades iguales de analito debe dar salidas de señal iguales. Alta fiabilidad y manejo sencillo Respuesta semejante para todos los analitos, Respuesta selectiva y altamente predecible para un reducido número de analitos.