Principios de Cromatografía Biomoléculas 2013

Presentación del tema: "Principios de Cromatografía Biomoléculas 2013"— Transcripción de la presentación:

1 Principios de Cromatografía Biomoléculas 2013
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2 ¿Qué es la Cromatografía?
Es un método de separación de mezclas en sus constituyentes individuales Tiene dos finalidades: Purificación Análisis Estampilla británica conmemorando al Nobel Martin Synge por la invención de la cromatografía

3 Por qué se llama Cromatografía
KHROMATOS (Color) GRAPHOS (Escritura) MIGUEL TSWEET (BOTANICO RUSO-1906). REALIZO LA PRIMERA CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA. Eter de petróleo CaSO4 Mezcla de pigmentos vegetales

4 Métodos:

5 Elementos básicos de la cromatografía
Fase estacionaria Fija Sólida: Sílica gel, alúmina,etc. Líquida: Solventes polares, no polares, y mixtos. Fase móvil Se desplaza Líquida: Solventes polares, no polares y mixtos. Gaseosa: Gas inerte (Nitrógeno, helio, etc. )

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7 CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA
Se utiliza una placa recubierta con fase estacionaria manteniendo un pequeño espesor constante a lo largo de la placa. El eluyente ascenderá, por capilaridad, por la placa y arrastrará los componentes a lo largo de ésta produciendo “manchas” de los componentes. Se usan láminas de: vidrio como soporte del adsorbente, plástico (ej: acetato) ó metálicos (ej: aluminio). Los tamaños de la placa para CCD convencional son: 20 x 20; 10 x 20 y 5 x 2. Hay placas que contienen un indicador de fluorescencia, para facilitar la identificación de las muestras. Si no se usa indicador y los componentes no son coloreados se requerirán técnicas de revelado.

8 CONCEPTO DE Rf. Rf= factor que se obtiene experimentalmente y me permite establecer la distancia recorrida por un soluto en relación a la fase móvil. Aplica en las cromatografías planas El valor de Rf depende de las condiciones en las cuales se corre la muestra (tipo de adsorbente, eluyente, así como las condiciones de la placa, temperatura, vapor de saturación, etc.).

9 El frente del solvente es de 8. 5, este será nuestro denominador
El frente del solvente es de 8.5, este será nuestro denominador. Por lo tanto la primera mancha con un numerador de 3.1 cm tiene un Rf = 0.36, mientras que la segunda mancha un Rf= 0.68

10 Eluyentes más comunes para cromatografía en capa fina.
éter de petróleo -tolueno -dietil-éter, t-butil-éter -diclorometano -acetato de etilo -n-pentano, n-hexano -ciclohexano -tetracloruro de carbono -cloroformo -acetona -iso-propanol -etanol -metanol -ácido acético

11 REVELADORES MÁS COMUNES PARA CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA
Las manchas de color son inmediatamente visibles; las incoloras pueden revelarse mediante: • Luz UV: si la sustancia absorbe luz ultravioleta, se puede usar una fase estacionaria impregnada con un indicador fluorescente (F254 ó F366), el número que aparece como subíndice nos indica la longitud de onda. • La introducción de la placa en vapores de yodo. • El rociado con una solución de Etanol/H2SO4 1:1 (dentro de un compartimiento especialmente protegido y bajo una campana de extracción de gases). Después calentar

12 Proceso de las separaciones cromatográficas
Fase móvil Fase estacio- naria Es la distribución de los constituyentes de una mezcla entre la fase estacionaria y la fase móvil.

13 Por qué se separan las sustancias?
Algunas sustancias son retenidas más fuertemente en la fase estacionaria por: Su mayor polaridad, lo que favorece su adsorción en dicha fase. La menor solubilidad en la fase móvil. Otras sustancias son menos retenidas, debido a: Su menor polaridad, lo que disminuye su capacidad de adsorción en la fase estacionaria. Su mayor solubilidad en la fase móvil

14 Clasificación de la cromatografía
Esta técnica analítica se clasifica de acuerdo a su mecanismo de separación en cromatografía de: Adsorción Exclusión Intercambio iónico Cromatografía de afinidad

15 Cromatografía de Adsorción
Usa una fase estacionaria sólida y una fase móvil líquida o gaseosa CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN Fase estacionaria: sólido. Fase móvil: Líquido ( CSL) Gas (CSG) El soluto se adsorbe sobre las superficie de las partículas sólidas, Pueden ser sistemas líquido/sólido y gas/sólido. En cualquier fenómeno de adsorción influyen tres variables: adsorbente, eluyente y solutos.

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17 . ácidos grasos libres diglicéridos monoglicéridos
triglicéridos . fosfolípidos; otros compuestos de mayor polaridad Punto de siembra fracción lipídica ácidos grasos libres diglicéridos monoglicéridos Revelado: vainillina-ácido sulfúrico (vainillina 1% en etanol; HsSO4 20 % en etanol).

18 Cromatografía de adsorción
Cromatografía líquido/ sólido: la fase estacionaria suele ser gel de sílice , alúmina, carbón activado o poliamida. Cromatografía gas /sólido: los adsorbentes mas usados son: alúmina, gel de sílice, carbón activado y mallas moleculares. Se realizan en columna. El material que sea utilizado como adsorbente debe presentar una estructura rígida, tamaño uniforme y ser químicamente inerte.

19 Cromatografía de Exclusión
La separación está basada en los diferentes volúmenes moleculares de los solutos. Se emplean geles no iónicos de partículas uniformes y porosos, como fase estacionaria.

20 También llamada de filtración por gel o de permeación por gel.
Separa moléculas por su tamaño, las moléculas grandes pasan más rápido que las pequeñas, no hay una interacción entre la fase estacionaria y el soluto, sino que la fase móvil pasa a través de un gel poroso. Los poros pequeños dejan pasar a las moléculas grandes y las moléculas pequeñas tardan más tiempo en pasar a través de la columna.

21 Cromatografía de intercambio iónico
En este tipo de cromatografía existen aniones como: -SO3- ,o cationes como: -N(CH3)3+ covalentemente unidos a la fase estacionaria sólida, que ordinariamente es una resina. Los iones de carga opuesta en solución son atraídos a la fase estacionaria por fuerzas electrostáticas. La fase móvil es un líquido.

22 Cromatografía de intercambio iónico
Los aniones móviles permanecen cerca de los cationes que están covalentemente unidos a la fase estacionaria Resina catiónica, que solo fija aniones.

23 Cromatografía de Afinidad
Es la más selectiva, emplea interacciones de moléculas de un soluto en particular y una segunda molécula que está unida covalentemente (inmovilizada) a la fase estacionaria. La molécula inmovilizada podría ser un anticuerpo unido a una proteína determinada. Solo la proteína que reacciona con el anticuerpo se fija en la columna.

24 Cromatografía de Afinidad
Todas las demás moléculas se eliminan Una clase específica de moléculas, se une a la fase estacionaria

25 Disolventes comúnmente utilizados
Pentano Ciclohexano Dioxano Benceno Éter etílico Cloroformo Cloruro de metileno Acetona Etanol Metanol Agua POLARIDAD

26 Aspectos físicos de la Cromatografía
Cromatograma, es un gráfico que representa la respuesta del detector en función del tiempo de elución. Tiempo de retención tr, de un componente es el tiempo necesario después de la inyección de una mezcla en la columna hasta que ese componente llegue al detector.

27 Aspectos físicos…. Volumen de retención Vr, el volumen de la fase móvil necesario para eluir un soluto determinado de la columna. Eluyente, fluido que entra por la columna. Eluato, fluido que sale por el extremo de la columna.

28 Eficacia de la separación
Diferencia de tiempos de elución de los respectivos picos, cuanto más distantes sean mejor. Ancho de los picos, cuanto más anchos sean los picos, peor la separación.

29 Cromatografía líquida.
Cromatografía de líquidos de alta eficiencia Fase móvil, líquido a alta presión Fase estacionaria sólido en columnas de un diámetro de 3 a 10 micras. Utiliza instrumentación especializada.

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31 Cromatografía de gases
La cromatografía de gases es un método físico de separación en el cual los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales constituye la fase estacionaria, de gran área superficial, y la otra es un GAS (fase móvil) que pasa a través o a lo largo de la fase estacionaria

32 Componentes de un Cromatógrafo de gases
Un suministro y una entrada de gas de acarreo Puerto de inyección Columna normalmente localizada en el interior de una cámara termostatizada (horno) Detector Sistema computarizado para analizar, registrar e imprimir el cromatograma

33 Cromatógrafo de gases

34 Inyección de la muestra
Las muestras líquidas se inyectan mediante una jeringa a través de septum, en un inyector caliente. El gas portador arrastra la muestra vaporizada desde el inyector a la columna

35 Gas portador El gas portador cumple básicamente dos propósitos:
Transportar los componentes de la muestra Crear una matriz adecuada para el detector. Un gas portador debe reunir ciertas condiciones: Debe ser inerte para evitar interacciones (tanto con la muestra como con la fase estacionaria) Debe ser capaz de minimizar la difusión gaseosa Fácilmente disponible y puro Económico Adecuado al detector a utilizar

36 Detectores: Conductividad térmica Llama ionizada Captura de electrones
Un detector nos indica qué sale de la columna. Los detectores más comunes y utilizados son: Conductividad térmica Llama ionizada Captura de electrones Detector de N y P Fotométrico de llama Conductividad electrolítica Fotoionización Infrarrojo Selectivo de masa Etc.

37 73 CROMATOGRAFÍA

38 Preguntas?