Cromatografía de Exclusión Molecular 4º Año de Laboratorio Químico Prof. Belkis Wandersleben W. C.E.A.L.A.

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1 Cromatografía de Exclusión Molecular 4º Año de Laboratorio Químico Prof. Belkis Wandersleben W. C.E.A.L.A.

2 La cromatografía de exclusión molecular (a menudo también llamada filtración en gel) es una de las técnicas más sencillas La cromatografía de exclusión molecular (a menudo también llamada filtración en gel) es una de las técnicas más sencillas de las empleadas en la separación de proteínas y ácidos nucleicos. de las empleadas en la separación de proteínas y ácidos nucleicos. Este tipo de cromatografía se realiza en columnas cilíndricas rellenas con algunos de los geles que se fabrican con este fin Este tipo de cromatografía se realiza en columnas cilíndricas rellenas con algunos de los geles que se fabrican con este fin (dextranos, agarosa o poliacrilamida). (dextranos, agarosa o poliacrilamida).

3 Descripción En esta cromatografía, la fase estacionaria consiste en largos polímeros entrecruzados que forman una red tridimensional porosa. En esta cromatografía, la fase estacionaria consiste en largos polímeros entrecruzados que forman una red tridimensional porosa. Las columnas se empaquetan con pequeñas partículas esferoidales formadas por esos polímeros entrecruzados. Las columnas se empaquetan con pequeñas partículas esferoidales formadas por esos polímeros entrecruzados.

4 En consecuencia, estas partículas son porosas, y el tamaño de los poros es tal que algunas moléculas (las demasiado grandes) no podrán ingresar a esos poros, en tanto que otras (las suficientemente pequeñas) podrán pasar a través de ellos. En consecuencia, estas partículas son porosas, y el tamaño de los poros es tal que algunas moléculas (las demasiado grandes) no podrán ingresar a esos poros, en tanto que otras (las suficientemente pequeñas) podrán pasar a través de ellos. Los poros quedan conectados formando una malla o red, lo cual determina una serie de caminos a ser recorridos por las moléculas que acceden al interior de esta. Los poros quedan conectados formando una malla o red, lo cual determina una serie de caminos a ser recorridos por las moléculas que acceden al interior de esta.

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6  Cuando se hace pasar una mezcla de moléculas de distinto tamaño, a través de una columna de filtración en gel; aquellas moléculas con un tamaño mayor que el diámetro de los poros de las partículas, sólo podrán moverse en su camino, a través de la fase estacionaria, en el espacio que queda entre las partículas; y por lo tanto, no se verán retrasadas en su descenso.

7  En cambio aquellas moléculas capaces de penetrar en las partículas se verán retrasadas por la fase estacionaria; en mayor medida, cuanto menor sea su tamaño. Por lo tanto, las moléculas eluyen en este tipo de cromatografía por orden decreciente de tamaño molecular.

8  Las mallas del gel permiten la entrada selectiva de las partículas de menor masa molecular. De ahí que las partículas de mayor peso molecular salgan primero.

9 Procedimiento  El gel, una vez hidratado, se deposita adecuadamente en una columna hueca de vidrio quedando listo para su uso.  Las moléculas de muy pequeño tamaño penetran en el interior de las esferas que componen el gel y, por consiguiente, no son extraídas de la columna hasta que no ha pasado a través de ella un volumen de líquido igual a su volumen total (vt)

10 Sin embargo, aquellas moléculas cuyo tamaño es mayor que el de los poros de las esferas del gel, no pueden penetrar en su interior y atraviesan la columna recorriendo únicamente el volumen vacío (Vo), siendo las primeras en salir de la columna. Sin embargo, aquellas moléculas cuyo tamaño es mayor que el de los poros de las esferas del gel, no pueden penetrar en su interior y atraviesan la columna recorriendo únicamente el volumen vacío (Vo), siendo las primeras en salir de la columna.

11 El resto de las moléculas, de tamaño intermedio, presentan una mayor o menor facilidad para difundir al interior de las esferas en función de su tamaño, siendo extraídas fraccionadamente con volúmenes que están comprendidos entre el Vt y el Vo. El resto de las moléculas, de tamaño intermedio, presentan una mayor o menor facilidad para difundir al interior de las esferas en función de su tamaño, siendo extraídas fraccionadamente con volúmenes que están comprendidos entre el Vt y el Vo.

12 Cuanto mayor es una molécula, menos capacidad tiene para acceder al interior de las esferas del gel y, por tanto, menor es el volumen de líquido que se requiere para extraerla de la columna. Cuanto mayor es una molécula, menos capacidad tiene para acceder al interior de las esferas del gel y, por tanto, menor es el volumen de líquido que se requiere para extraerla de la columna.

13 Teniendo en cuenta que para las proteínas globulares el tamaño está, en general, relacionado con el peso molecular, este tipo de cromatografía separa las sustancias en función de dichos pesos moleculares, obteniéndose primero las más pesadas. Teniendo en cuenta que para las proteínas globulares el tamaño está, en general, relacionado con el peso molecular, este tipo de cromatografía separa las sustancias en función de dichos pesos moleculares, obteniéndose primero las más pesadas.

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15 Definición de parámetros  Intervalo de fraccionamiento de un determinado tipo de gel, como los valores extremos (Máximo y mínimo) de pesos moleculares entre los cuales el gel tiene capacidad de separar.  Volumen de elución, es el volumen necesario para eluir un compuesto de una columna.

16  Volumen de exclusión: volumen al que eluyen las moléculas de tamaño superior al intervalo de fraccionamiento del gel. Corresponde a la suma del volumen de los huecos entre las partículas de gel.

17  Kd = Ve-Vo/Vt-Vo El valor de Kd oscila entre 0 (cuando Ve=Vo) y 1 (cuando Ve=Vt), y representa la fracción de volumen del interior de las esferas a la que accede cada sustancia en virtud de su tamaño. El valor de Kd oscila entre 0 (cuando Ve=Vo) y 1 (cuando Ve=Vt), y representa la fracción de volumen del interior de las esferas a la que accede cada sustancia en virtud de su tamaño.

18 Factores que influyen en la separación  Longitud de la columna. La capacidad de separación de sustancias de diferente tamaño aumenta con la longitud de la columna.  Flujo. La resolución de la separación disminuye al aumentar el flujo del líquido con que son arrastradas las moléculas a lo largo de la columna.

19  El volumen de la muestra a cromatografiar debe ser pequeño comparado con el volumen total de la columna. Las mejores separaciones se obtienen aplicando volúmenes de muestra iguales o menores al 5% del volumen total.  Empaquetado del gel en la columna. Las propiedades separadoras del gel se alteran profundamente, e incluso desaparecen, cuando un gel no está empaquetado homogéneamente en la columna o se encuentra excesivamente comprimido.

20 Grados de los Geles

21 APLICACIONES  Desalado. Proteínas, polisacáridos, polipéptidos etc. pueden ser desalados antes de ser concentrados o liofilizados.  Eliminación de fenol de las preparaciones de ácidos nucleicos.  Eliminación de compuestos de bajo peso molecular marcados.  Para reacciones entre macromoléculas y reactivos de bajo peso molecular.  Eliminación de productos, cofactores, inhibidores, etc. de las enzimas.  Purificación de macromoléculas.  Determinación del peso molecular de las proteínas.