CROMATOGRAFÍA ANALISIS DE LOS ALIMENTOS II MAITE VIVAR/DANIELA AGUILAR/ CIRILA CORTEZ

INTRODUCCIÓN La etimología de la palabra cromatografía, por las palabras griegas que la forman significaría: “escritura en colores”. La aplicó a la separación de los pigmentos naturales que se encuentran en las plantas (conocidos como carotenoides y clorofilas El botánico ruso Mikhail S. Tsvet formalizó el uso de la cromatografía en los estudios científicos.

INTRODUCCIÓN Aplicación Técnicas de separación sirven para separar componentes de una muestra. Realizar el seguimiento de una síntesis que podría ir asociada a la preparación de un material Desde el punto de vista de la caracterización de los materiales, conocer la composición de los mismos

LUGAR QUE OCUPA LA CROMATOGRAFÍA EN LA CARACTERIZACIÓN DE MATERIALES Pasos a seguir en cuanto a la manipulación de una determinada muestra hasta que se la caracteriza mediante el empleo de una técnica o método instrumental.

TERMINOLOGÍA CROMATOGRAFÍA FASE ESTACIONARIA La cromatografía es un método físico de separación en el que los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales está en reposo (fase estacionaria o lecho estacionario) mientras que la otra (fase móvil) se mueve en una dirección definida. FASE ESTACIONARIA Es una de las dos fases que forman un sistema cromatográfico. Puede ser un sólido, un gel o un líquido. La expresión lecho cromatográfico se puede usar como término general para designarla.

TERMINOLOGÍA FASE MÓVIL ELUIR Fluido que se filtra a lo largo del lecho estacionario, en una dirección definida. Puede ser un líquido (cromatografía líquida, LC), un gas (cromatografía de gases, GC) o un fluido supercrítico (cromatografía con fluido supercrítico). En la cromatografía de elución se usa también para la fase móvil la expresión eluyente. ELUIR Proceso en el que la fase móvil se desplaza a lo largo de la fase estacionaria transportando los componentes a separar. Se prefiere el término "Eluir" a "Desarrollar“.

TERMINOLOGÍA

TERMINOLOGIA SOLUTO DISOLVENTE CROMATÓGRAFO Término que se refiere a los componentes de la muestra en la cromatografía de reparto. DISOLVENTE Término que en ocasiones se refiere a la fase estacionaria líquida en la cromatografía de reparto. CROMATÓGRAFO Cromatógrafo El instrumento empleado para realizar una separación cromatográfica

CLASIFICACION CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS CROMATOGRAFIA DE GASES CROMATOGRAFIA DE FLUIDOS SUPERCRITICOS

CROMATOGRAFÍA DE LIQUIDOS Fase Estacionaria Solida: La fase estacionaria es un sólido en el que los componentes de la muestra son adsorbidos. La fase móvil puede ser un líquido (cromatografía líquido-sólido) o un gas (cromatografía gas-sólido). La cromatografía de capa fina (TLC) es un ejemplo Cromatografía de Adsorción

CROMATOGRAFÍA DE LIQUIDOS

CROMATOGRAFÍA DE LIQUIDOS

CROMATOGRAFÍA DE LIQUIDOS La fase estacionaria presenta en su superficie grupos ionizados capaces de retener selectivamente iones de signo contrario a la que circulan en la fase móvil. Cromatografía de Cambio Iónico La fase estacionara, en este caso, es un material poroso, de tamaño de poro controlado, que permite la entrada de ciertas moléculas de manera selectiva, dejando fuera otros de mayor tamaño. Cromatografía de Exclusión

CROMATOGRAFÍA DE LIQUIDOS

CROMATOGRAFÍA DE LIQUIDOS Fase Estacionaria Liquida: Cromatografía de Reparto La fase estacionaria es un líquido soportado en un sólido inerte. La fase móvil puede ser un líquido (cromatografía de partición líquido-líquido) o un gas (cromatografía de partición gas-líquido, GLC). La cromatografía en papel es un ejemplo

CROMATOGRAFÍA DE LIQUIDOS Cromatografía de Afinidad La Fase Estacionaria por lo general es un polímero de tipo liquido inmovilizado sobre un sólido inerte En ambos casos la separación se debe a equilibrios de distribución de los solutos en la fase móvil y estacionaria.

CROMATOGRAFÍA DE LIQUIDOS

CROMATOGRAFIA DE FLUIDOS SUPERCRITICOS

QUE ES? Es una técnica híbrida que combina lo mejor de la cromatografía de gases y la cromatografía liquida. Permite la separación de mezclas en las que no es adecuada la aplicación de la (CG)ni de la (CL). se aplica a compuestos no volátiles o térmicamente inestables que no pueden separarse mediante (CG), o los que contienen grupos funcionales que imposibilitan su detección en la (CL).

Clasificacion de acuerdo a como se ponen en contacto las fases: Cromatografía en columna Cromatografía plana

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA la FE se coloca en el interior de una columna de vidrio, la cual finaliza con una llave para controlar el paso de sustancias al exterior de la columna. La FE se impregna con el eluyente (FM). la muestra se deposita por la parte superior de la FE, y así la FM podrá ir atravesando el sistema. Los compuestos que están en la FM, saldrán de la columna cromatográfica, y se recogen en fracciones.

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA Las fracciones menos polares, serán las primeras en salir de la columna. En cambio, las sustancias más polares, quedan retenidas por más tiempo en el absorbente. La cromatografía en columna puede realizarse por gravedad o a media presión

CROMATOGRAFÍA PLANA Técnica de separación en la que la fase estacionaria está sobre un plano, Éste puede ser un papel, que sirva como tal o que esté impregnado con una sustancia que actúe de fase estacionaria (Cp), o capa de partículas sólidas extendida sobre un soporte, como una placa de vidrio (Ccf). A veces a la cromatografía plana se la llama también cromatografía de lecho abierto.

CROMATOGRAFIA PLANA Cromatografía en papel. Cromatografía en capa fina.

CROMATOGRAFÍA EN PAPEL La FE está constituida por una tira de papel de filtro. La muestra se deposita en un extremo colocando gotas de la disolución y evaporando el disolvente. Luego el disolvente empleado como FM se hace ascender por capilaridad. La separación se realiza en función de la afinidad de los solutos con las dos fases, las más solubles en agua se quedarán cerca del punto, y las menos solubles en agua y más solubles en el disolvente llegarán más lejos.

CROMATOGRAFÍA EN PAPEL Al entrar en contacto con los disolventes empieza su fase de movilidad lo que produce unas manchas características sobre el papel. La FE es una hoja de papel de celulosa de elevada pureza. La FM, se forma por disolventes cuya naturaleza se elige en función de los componentes que se pretenden separar.

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA Se basa en la preparación de una capa uniforme de un adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte. La FM es líquida y FE es un sólido. La FE será un componente polar y el eluyente será menos polar que la FE, y los componentes que se desplacen con mayor velocidad serán los menos polares. El tiempo que se necesita para conseguir las separaciones es menor y la separación es mejor.

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA Se utiliza como reactivo revelador yodo, forma complejos coloreados con los componentes orgánicos, pero las manchas desaparecen con el tiempo. Sin embargo el tamaño de las manchas no está relacionado con la cantidad de componente separado.

CROMATOGRAFIA DE GASES (CG)

Cromatografía de gases Técnica analítica que permite separar mezclas de compuestos fácilmente volátiles y térmicamente estables en sus componentes individuales; además se puede, cualificar y cuantificar los componentes La clasificación mas frecuente en cromatografía, la marca el tipo de fase móvil, en este sentido la cromatografía de gases emplea como fase móvil un gas. Fase estacionaria: parte que no se mueve con la muestra. Fase móvil: gas o líquido que arrastra a los componentes.

Técnica La muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. La elución se produce por el flujo de una fase móvil de gas inerte, la fase móvil no interacciona con las moléculas del analito. Se produce la separación de los componentes de la mezcla, que finalmente son determinados gracias a un detector que amplifica la señal integrándola.

Descripción del equipo Los componentes fundamentales de un cromatógrafo de gases, son: Fuente de gas. Sistema de inyección. Horno y columna cromatografía. Sistema de detección. Sistema de registro.

Tipos de CG Cromatografía Gas-Sólido (CGS): cuya fase estacionaria es un sólido y el tipo de equilibrio con la fase móvil es de una adsorción. Cromatografía Gas-Líquido (CGL): cuya fase estacionaria es un líquido retenido por impregnación o por enlace sobre un sólido inerte. Se base en equilibrios de distribución.

Limitaciones En cromatografía de gases, la influencia de la temperatura sobre la distribución del equilibrio es considerable, a diferencia de la cromatografía líquida. Presenta limitaciones en tres casos: Compuestos poco volátiles, generalmente los de peso molecular superior a 300 u.m.a. Compuestos sensibles a una elevación de la temperatura incluso moderada. Compuestos que se encuentran en forma iónica (poco volátiles).

La CG se emplea cuando los componentes de la mezcla son volátiles o semivolátilesy térmicamente estables a temperaturas e hasta 350-400 oC; en cambio, cuando los compuestos son poco volátiles y /o termolábiles, la técnica separativa adecuada suele ser la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

Sistema de inyección de la muestra La eficacia de la columna requiere una muestra de tamaño adecuado. La inyección lenta de muestras demasiado grandes provoca un ensanchamiento de las bandas y baja resolución. El uso de microjeringas a través de una septum es el método más eficaz. La muestra pasa a una cámara de vaporización instantánea.

Sistema de inyección de la muestra La vaporización e introducción de las muestras en el sistema, debe realizarse cumpliendo una serie de requisitos: 1.- La vaporización de la muestra debe ser lo más rápida posible. 2.- La vaporización debe realizarse sin discriminar ningún componente de la muestra. 3.- La muestra debe llegar a la columna como una banda lo más fina posible.

Gas Portador El gas portador cumple básicamente dos propósitos: Transportar los componentes de la muestra, y crear una matriz adecuada para el detector. Un gas portador debe reunir ciertas condiciones: Debe ser inerte para evitar interacciones (tanto con la muestra como con la fase estacionaria) Debe ser capaz de minimizar la difusión gaseosa Fácilmente disponible y puro Económico Adecuado al detector a utilizar

Configuración de la columna y del horno En CG se emplean dos tipos de columnas, las empaquetadas y las capilares. La temperatura de la columna es una variable importante parar un trabajo preciso. La temperatura optima depende del punto de ebullición de la muestra y del grado de separación requerido. En general, la resolución óptima se asocia con una temperatura mínima; en contrapartida la reducción de temperatura produce un aumento en el tiempo de elución.

‘ Detectores Las características de un detector ideal deber ser las siguientes: Adecuada sensibilidad, buena estabilidad y reproducibilidad. Respuesta lineal, amplio intervalo de temperatura de trabajo. Tiempo de respuesta corto, alta fiabilidad y manejo sencillo y no destructivo.

Tipos de detectores Existe un gran número de detectores cuya elección depende del tipo de componente a determinar. Las más comunes son: Detector de Ionización de llama (FID). Detector de conductividad térmica (TCD). Detector de captura electrónica (ECD). Detector de nitrógeno/fósforo (NPD). Detector Quimioluminiscencia de azufre. Detector de emisión atómica (AED). Detector termoiónico (TID). Detector fotométrico de llama (FPD). Detector de fotoionización (PID), etc.

Detector de ionización de llama El detector de ionización de llama, es tal vez el más ampliamente utilizado en cromatografía de gases. Este tipo de detector es en la práctica de respuesta universal, ya que es selectivo hacia los compuestos que presenten enlaces C-H, por lo que son muy pocos los compuestos que no dan señal en él.

Análisis cuantitativo En la cromatografía en columna, el análisis cuantitativo se basa en la comparación de la altura, o del área, del pico del analito con la de uno o más patrones inyectados bajo las mismas condiciones cromatográficas. El uso de una u otro termino dependerá de las características de la banda obtenida, aunque en la actualidad con el uso de sistemas de integración de área computarizados, la precisión es muy alta para el calculo de área, sin embargo siempre es importante conocer las otras herramientas a utilizar para calcular el área de una banda y en que momento es mejor usar altura en vez de área por si llega a faltar el sistema computarizado.

Para lograr un análisis cuantitativo de los componentes separados de una muestra existe una gran variedad de métodos de análisis entre los que se pueden mencionar: 1. Calibración absoluta 2. Método del estándar interno. 3. Normalización de área (con y sin factor de respuesta)

Calibración absoluta Para realizar el cálculo de composición, se inyecta masas exactas del componente puro al cromatógrafo y se determina el área.

La ecuación de esta curva vendrá dada por: A= mW Entonces se inyecta una masa exacta de la muestra (Winj) y se determina el área del componente a analizar, por ejemplo el componente A, de la curva extrapolando la masa de A por WA= AA/m y después se aplica la siguiente ecuación: %WA =WA/Winj *100

Método del estándar interno Este método es conocido como calibración relativa o indirecta. Para ello, relación de masas conocidas de un patrón de la muestra y de un estándar deber ser preparadas e inyectadas al cromatógrafo para luego determinar las relaciones de área.

De esta curva se obtiene la ecuación lineal y = mx. Entonces se adiciona una masa conocida del estándar interno a una masa conocida de muestra y esta mezcla se inyecta al cromatógrafo. Del cromatógrama se obtienen las áreas de analito y del estándar y luego con la ecuación de calibración y conociendo la masa del estándar se puede obtener la masa del analito en la muestra. A partir de esta masa se puede calcular el % de este componente en la muestra como sigue:

Normalización de área La normalización de área es un medio para establecer el porcentaje de cada componente en la muestra. Se calcula dividiendo el área de cada componente entre el área total y multiplicando por 100%, es decir: Este término es independiente del volumen de inyección de muestra y debe cumplirse que todos los picos deben estar separados. Sin embargo, esta ecuación solo se puede aplicar para una serie homologa de compuestos de punto de ebullición muy parecidos y con similares respuestas del detector, algo mas acorde con la realidad es usar el factor de respuesta.

Aplicaciones Medioambientales: Análisis de pesticidas y herbicidas, análisis de hidrocarburos, semivolátiles y volátiles, análisis del aire. Alimentos y aromas: fragancias y aromas, aceites, bebidas, ácidos orgánicos, azúcares, FAMES, ésteres metílicos, triglicéridos, alcoholes. Química Industrial: alcoholes, ácidos orgánicos, aminas, aldehídos y cetonas, ésteres y glicoles, hidrocarburos, disolventes, anilinas, gases inorgánicos.