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HEMOFILIA ENFERMEDAD DE VON WILLEBRAND. PREVALENCIA - Hemofilia A1/5000 - Hemofilia B1/25000 - VWD3% población.

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1 HEMOFILIA ENFERMEDAD DE VON WILLEBRAND

2 PREVALENCIA - Hemofilia A1/ Hemofilia B1/ VWD3% población

3 protómero dominios funcionales ligandos Colágeno GPIIb-IIIa FVIII GPIb Heparina Heparina Colágeno Sulfátidos D 1 D 2 D D 3 A 1 A 2 A 3 D 4 BC 1 C 2 D D 3 A 1 A 2 A 3 D 4 BC 1 C S I S I S RGD RGD Factor von Willebrand Propéptido Subunidad Madura

4 GOLGI RETICULO ENDOPLASMICO Furina Sadler JE, 2005 vWF Ensamble Multímeros

5 Sadler JE, 2005 vWF Ensamble y Catabolismo Proteolisis aumentada (vWD2A) Depuración aumentada (vWD1 Vicenza) Plasma Inicial k proteolisis k depuración ADAMTS-13 k secreción

6 IIa A1A2 B A3 C1 C2 200kD 80kD 200kD 80kD 90kD HRG 80kD 50kD 43kD 73kD 45kD 67kD FACTOR VIII NH 2 SecreciónPreactivaciónActivaciónInactivación IIaIIa APC IIa Xa Xa Lollar P & Parker CG, 1989

7 FVIII-VWF S-SS-S VWF FVIII FVIIIa IIa, FXa A1 A2 C2 C1 A3 N N C C A1 A2 A3 C1 C2 B Vlot et al., 1998

8 FVIII/VWF - Propiedades FVIII VWF ClínicaHemofilia vWD ProducciónS. Hepáticos C. Endoteliales Megacariocitos Megacariocitos GenCromosoma X Cromosoma 12 MoléculaHeterodímero Multímero FunciónCoagulación Procofactor Adhesión Adhesión Endotelio/Sub Endotelio/Sub Transporta FVIII Transporta FVIII

9 FVIII/VWF - Nomenclatura Factor VIII Antígeno FVIII:Ag Función FVIII Factor von Willebrand Proteína Madura VWF Antígeno VWF:Ag Cofactor Ristocetina VWF:RCo Unión al Colágeno VWF:CB Unión al Factor VIII VWF:FVIIIB ISTH

10 Recesiva Ligada al sexo (gen FVIII Cr X) PORTADORA HEMOFILIA A HEMOFILICO

11 HEMOFILIA Modo de Herencia

12 HEMOFILIA

13

14 HEMOFILIA Diagnóstico sencillo - APTT prolongado - FVIII disminuido

15 HEMOFILIA - Clasificación Severa< 1% VIII Moderada1-5% VIII Leve>5% VIII

16 HEMOFILIA Diagnóstico de Portadoras

17 Padre hemofílico Padre hemofílico Hijo hemofílico y antecedentes Hijo hemofílico y antecedentes (vía materna) 2 o más hijos, sin antecedentes familiares 2 o más hijos, sin antecedentes familiares PORTADORA OBLIGADA No requiere estudio

18 Hijo hemofílico, sin antecedentes familiares Hijo hemofílico, sin antecedentes familiares Sin hijos y con antecedentes (vía materna) Sin hijos y con antecedentes (vía materna) Dificultad diagnóstica PORTADORA POTENCIAL

19 PORTADORAS Lyonización XM XPXM XPXM XPXM XP XPXPXPXP XMXMXMXM XMXMXMXM XPXPXPXP XMXMXMXM XPXPXPXP XMXMXMXM XPXPXPXP XPXPXPXP XMXMXMXM XPXPXPXP XMXMXMXM Ovulo Fertilizado HeterocigotaClones

20 PORTADORAS HEMOFILIA Factor VIII Portadoras Normales probabilidad FVIII

21 Bioensayos DESVENTAJAS Probabilidad Probabilidad Error por lyonización extrema Error por lyonización extrema

22 VENTAJAS Certeza Certeza Independiente de lyonización Independiente de lyonización Análisis de ADN

23 Alteración heterogénea Alteración heterogénea Afecta diferentes regiones Afecta diferentes regiones del gen No aplicable a todos los casos No aplicable a todos los casos Análisis de ADN Complejo

24 Análisis de segregación de RFLP ? -/ /- - -/- PORTADORA (-) asociado al defecto IDENTIFICACION INDIRECTA No Certeza

25 Inversión del intrón 22 50% hemofílicos severos 50% hemofílicos severos IDENTIFIACION DIRECTA Certeza

26 Inversiones Inversiones Deleciones Deleciones Inserciones Inserciones Mutaciones sin sentido Mutaciones sin sentido Mutaciones sentido falso Mutaciones sentido falso IDENTIFIACION DIRECTA

27 Recesiva Ligada al sexo (gen FIX Cr X) PORTADORA HEMOFILIA B HEMOFILICO

28 HEMOFILIA - Clasificación Severa< 1% IX Moderada1-5% IX Leve>5% IX

29 HEMOFILIA B Diagnóstico sencillo - APTT prolongado - FIX disminuido

30 protómero dominios funcionales ligandos Colágeno GPIIb-IIIa FVIII GPIb Heparina Heparina Colágeno Sulfátidos D 1 D 2 D D 3 A 1 A 2 A 3 D 4 BC 1 C 2 D D 3 A 1 A 2 A 3 D 4 BC 1 C S I S I S RGD RGD Factor von Willebrand Propéptido Subunidad Madura

31 VWD Clasificación Revisada Sadler E, 1994 Tipo 1Deficiencia cuantitativa parcial Tipo 2Alteración cualitativa Tipo 3Ausenciade VWF

32 VWD Genética VWFCromosoma 12 (12p12 12pter)

33 VWD – TIPOS Frecuencia (%) TIPO 1 TIPO 2 TIPO 3 Tuddenham (134) Lenk (111) Nilson (106f) Hoyer (116) Awidi (65) 5929,511,5 Berliner (60) Castaman G, 2003

34 VWD Serie 1885 Pacientes (Tipo I 91%) FVIII 61,6% FVIII 61,6% VWF:Ag62,2% VWF:Ag62,2% TS 58,4% TS 58,4% Woods AI, 2001

35 VWF Expresión Variable Penetrancia Incompleta Chance Modificadires Ambientales edad, género, trauma Enfermedad primaria mutación ? Genes modificadores Ginsburg D, 2001 Difícil Diagnóstico Niveles Variables VWF

36 Individual Individual Familiar Familiar VWF-Variabilidad

37 VWF-Variabilidad Factores 40% no genéticos 40% no genéticos 60% genéticos 60% genéticos

38 VWF-Variabilidad Factores no-genéticos Edad Edad Estrés Estrés Ejercicio Ejercicio H. Tiroideas H. Tiroideas Estrógenos Estrógenos F.Aguda F.Aguda

39 VWF-Variabilidad Factores genéticos Grupo ABO 20-30% variabilidad Grupo ABO 20-30% variabilidad Grupo O VWF Hipótesis Glicosilación Glicosilación Alteración procesamiento procesamiento estabilidad estabilidad secreción secreción

40 VWD Distribución según grupo ABO AB 0,6% difícil diagnóstico AB 0,6% difícil diagnóstico O 70% más sintomático O 70% más sintomático > frecuencia de consulta Woods AI, 2001

41 Cuantitativa Cualitativa VWF:Ag SI NO VWF:RCo SI SI VWF:CB SI SI Multímeros SEMI SI VWF Pruebas Específicas

42 VWF-ELISA Anti-VWF inmovilizado a-vWFvWFa-vWF-HRPColor-Abs 2. Incubación con muestra o control 3. Incubación con anti-VWF-conjugado 4. Incubación con sustrato cromogénico

43 VWF:RCo Plasma del paciente Plaquetasnormales

44 VWF:RCo Plaquetasnormales paciente Ristocetina Agregación c/Ristocetina Agregometría

45 VWF:RCo Plaquetasnormales Plasma del paciente Ristocetina Plaquetas del paciente Plasma del paciente Agregación c/Ristocetina Agregometría PRP

46 VWF:RCo Plaquetasnormales Plasma del paciente Ristocetina Plaquetas del paciente Plasma Ristocetina Agregación c/Ristocetina Agregometría Agregometría PRP

47 Kasper C, 2005 Normal vWD-Tipo 1 vWD-Tipo 2A vWD-Tipo 3

48 VWF:CBUnión Colágeno Colágeno Tipo III BSA Muestra a- vWF conejo IgG F(ab) 2 * Citometría de flujo 1. Inmovilización Bloqueo 3. Colágeno VWF 4. VWF a-VWF 5. a-VWF IgGF(ab) 2fluoresceína 6. Adquisición Esferaspoliestireno

49 Actividad VWF-ELISA a-vWFvWFa-vWF-HRPColor-Abs 1. AcMo a-vWF epitope funcional inmovilizado 2. Incubación con muestra o control 3. Incubación con anti-vWF-conjugado 4. Incubación con sustrato cromogénico

50 Agregación c/Ristocetina Kasper C, 2005

51 2B Normal 2A Línea 1 Línea 2 Línea 3 Lane 3> VWF-Análisis Multimérico grandes intermedios-pequeños (banda 1)(banda 2)

52 2A función plaquetaria Multímeros APM Multímeros APM vWD-Tipo 2 Clasificación Revisada Sadler E, B afinidad VWF-GPIb-IX 2M función plaquetaria c/Multímeros APM 2N afinidad VWF-FVIII* * símil Hemofilia A, autosómica

53 protómero dominios funcionales ligandos Colágeno GPIIb-IIIa FVIII GPIb Heparina Heparina Colágeno Sulfátidos D 1 D 2 D D 3 A 1 A 2 A 3 D 4 BC 1 C 2 D D 3 A 1 A 2 A 3 D 4 BC 1 C S I S I S RGD RGD Factor von Willebrand Propéptido Subunidad Madura X

54 Anticuerpo a-vWF inmovilizado a-vWFvWFFVIIIColor-Abs CaCl 2 0,4M 2. Incubación con muestra o control 3. Incubación FVIII purificado/CaCl 2 4. Incubación con sustrato cromogénico VWF:FVIIIB Enlace FVIII VWF

55 Referencia Paciente 1 Paciente 2 Absorbancia405nm

56 2N-Variante Normandy Biología Molecular -Secuenciación -Enz. restricción

57 VWF- Arg19Trp (C2594T) Exón 18 Enzima BspMI pb pb 3-96 pb Normal 148 pb 96 pb Mutado 244 pb 123 MutaciónNormal

58 T. Sangría T. Sangría APTT (fVIII) APTT (fVIII) Adhesividad Adhesividad Tiempo de obstrucción (PFA) Tiempo de obstrucción (PFA) Screening VWD Estrategia Diagnóstica * *no permiten excluir VWD

59 -VWF plasma/plaquetas VWD Estrategia Diagnóstica Diagnóstico VWF:Ag VWF:Ag VWF:RCo VWF:RCo VWF:CB VWF:CB -FVIII en plasma

60 Multímeros Multímeros RIPA RIPA Unión GP plaquetarias Unión GP plaquetarias VWF:FVIIIB VWF:FVIIIB Biología Molecular Biología Molecular VWD Estrategia Diagnóstica Clasificación

61 vWD- Importancia Dignóstica VWF:RCo Prueba más sensible VWF:Ag Correlaciona VWF:RCo Ratio=1 Tipo1 Ratio<1 Tipo2 FVIII Util para el manejo clínico T. Sangría Correlaciona VWF:RCo (T1) Detecta defecto plaquetario RIPA Detecta Tipo 2B Castaman G, 2003

62 vWD- Importancia Dignóstica A.Multimérico Discrimina Tipo 2M, 2A, 2B VWF plaquetario Predice respuesta DDAVP Tipo 1 VWF:FVIIIB Detecta Tipo 2N VWF:CB Correlaciona VWF:RCo (T1) Sensibilidad colágeno CT PFA-100 Especificidad (?) Castaman G, 2003

63 HEMOFILIA VON WILLEBRAND Diagnóstico Diferencial

64 Cofactor de ristocetina * Cofactor de ristocetina * Antígeno de factor vW o N Antígeno de factor vW o N Factor VIII o N Factor VIII o N Tiempo de Sangría o N Tiempo de Sangría o N *excepto la variante 2N Enfermedad de von Willebrand

65 Cofactor de ristocetinaN Cofactor de ristocetinaN Antígeno de factor vW N Antígeno de factor vW N Factor VIII Factor VIII Tiempo de Sangría N Tiempo de Sangría N Hemofilia

66 Hemofilia VWD2N Hemofilia VWD2N VWF:RCo N N Factor VIII Factor VIII VWF:FVIIIB N VWF:FVIIIB N Hemofilia-VWD 2N

67 Diagnóstico Diagnóstico Control de terapéutica Control de terapéutica VWD Laboratorio

68 COAGULPATIAS Orientación Diagnóstica

69 XII XIIa XI XIa IX IXa VIIIaFL Ca 2+ FC XXaVaFL IIa IIa Fibrinógeno M. Fibrina M. Fibrina Fibrina FibrinaFibrinógeno M. Fibrina M. Fibrina Fibrina Fibrina FTVIIa Ca 2+ XIIIa Activación II V. INTRINSECA TTPA V. EXTRINSECA TP V. FINAL TT TT PRUEBAS

70 INTERPRETACION Pruebas DEFECTO (probable) TP TP APTT, TT, TS Normales V. Extrínseca (FVII) Déficit de factores Vit K Dep. Hepatopatía TP, APTT TP, APTT TT, TS Normales V. Común, Déficit de factores Vit K Dep., Hepatopatía TP, APTT, TT, TS TP, APTT, TT, TS Hepatopatía, CID TP, APTT, TT TP, APTT, TT TS Normal V. Final Fibrinógeno APTT APTT TP, TT, TS Normal V. Intrínseca (FVIII, FIX, FXI, FXII) Hemofilia, VWD APTT, TS APTT, TS TP, TT Normales VWD

71 INTERPRETACION Pruebas DEFECTO (probable) TP TP APTT, TT, TS Normales V. Extrínseca (FVII) Déficit de factores Vit K Dep. Hepatopatía TP, APTT TP, APTT TT, TS Normales V. Común, Déficit de factores Vit K Dep., Hepatopatía TP, APTT, TT, TS TP, APTT, TT, TS Hepatopatía, CID TP, APTT, TT TP, APTT, TT TS Normal V. Final Fibrinógeno APTT APTT TP, TT, TS Normal V. Intrínseca (FVIII, FIX, FXI, FXII) Hemofilia, VWD APTT, TS APTT, TS TP, TT Normales VWD

72 INTERPRETACION Pruebas DEFECTO (probable) TP TP APTT, TT, TS Normales V. Extrínseca (FVII) Déficit de factores Vit K Dep. Hepatopatía TP, APTT TP, APTT TT, TS Normales V. Común, Déficit de factores Vit K Dep., Hepatopatía TP, APTT, TT, TS TP, APTT, TT, TS Hepatopatía, CID TP, APTT, TT TP, APTT, TT TS Normal V. Final Fibrinógeno APTT APTT TP, TT, TS Normal V. Intrínseca (FVIII, FIX, FXI, FXII) Hemofilia, VWD APTT, TS APTT, TS TP, TT Normales VWD

73 INTERPRETACION Pruebas DEFECTO (probable) TP TP APTT, TT, TS Normales V. Extrínseca (FVII) Déficit de factores Vit K Dep. Hepatopatía TP, APTT TP, APTT TT, TS Normales V. Común, Déficit de factores Vit K Dep., Hepatopatía TP, APTT, TT, TS TP, APTT, TT, TS Hepatopatía, CID TP, APTT, TT TP, APTT, TT TS Normal V. Final Fibrinógeno APTT APTT TP, TT, TS Normal V. Intrínseca (FVIII, FIX, FXI, FXII) Hemofilia, VWD APTT, TS APTT, TS TP, TT Normales VWD

74 INTERPRETACION Pruebas DEFECTO (probable) TP TP APTT, TT, TS Normales V. Extrínseca (FVII) Déficit de factores Vit K Dep. Hepatopatía TP, APTT TP, APTT TT, TS Normales V. Común, Déficit de factores Vit K Dep., Hepatopatía TP, APTT, TT, TS TP, APTT, TT, TS Hepatopatía, CID TP, APTT, TT TP, APTT, TT TS Normal V. Final Fibrinógeno APTT APTT TP, TT, TS Normal V. Intrínseca (FVIII, FIX, FXI, FXII) Hemofilia, VWD APTT, TS APTT, TS TP, TT Normales VWD

75 INTERPRETACION Pruebas DEFECTO (probable) TP TP APTT, TT, TS Normales V. Extrínseca (FVII) Déficit de factores Vit K Dep. Hepatopatía TP, APTT TP, APTT TT, TS Normales V. Común, Déficit de factores Vit K Dep., Hepatopatía TP, APTT, TT, TS TP, APTT, TT, TS Hepatopatía, CID TP, APTT, TT TP, APTT, TT TS Normal V. Final Fibrinógeno APTT APTT TP, TT, TS Normal V. Intrínseca (FVIII, FIX, FXI, FXII) Hemofilia, VWD APTT, TS APTT, TS TP, TT Normales VWD

76 INTERPRETACION Pruebas DEFECTO (probable) TP TP APTT, TT, TS Normales V. Extrínseca (FVII) Déficit de factores Vit K Dep. Hepatopatía TP, APTT TP, APTT TT, TS Normales V. Común, Déficit de factores Vit K Dep., Hepatopatía TP, APTT, TT, TS TP, APTT, TT, TS Hepatopatía, CID TP, APTT, TT TP, APTT, TT TS Normal V. Final Fibrinógeno APTT APTT TP, TT, TS Normal V. Intrínseca (FVIII, FIX, FXI, FXII) Hemofilia, VWD APTT, TS APTT, TS TP, TT Normales VWD

77 Gracias


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