HEMOFILIA ENFERMEDAD DE VON WILLEBRAND.

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1 HEMOFILIA ENFERMEDAD DE VON WILLEBRAND

2 PREVALENCIA Hemofilia A 1/ Hemofilia B 1/ VWD 3% población

3 Propéptido Subunidad Madura
protómero dominios funcionales ligandos Factor von Willebrand Propéptido Subunidad Madura I S D D2 D’ D3 A1A2A3 D4BC1C2 S I D’ D A1A2A3 D4BC1C2 S I RGD Colágeno GPIIb-IIIa FVIII GPIb Heparina Heparina Colágeno Sulfátidos

4 vWF Ensamble Multímeros
RETICULO ENDOPLASMICO GOLGI vWF Ensamble Multímeros Furina Sadler JE, 2005

5 vWF Ensamble y Catabolismo
Proteolisis aumentada (vWD2A) ADAMTS-13 kproteolisis Inicial Plasma vWF Ensamble y Catabolismo ksecreción kdepuración Depuración aumentada (vWD1 Vicenza) Sadler JE, 2005

6 FACTOR VIII A1 A2 B A3 C1 C2 Secreción Preactivación Activación
NH 2 A1 A2 B A3 C1 C2 Secreción Preactivación Activación Inactivación 200kD kD IIa 1648 90kD HRG kD IIa 740 IIa 50kD kD kD 372 APC IIa Xa Xa 1689 45kD kD 336 1721 Lollar P & Parker CG, 1989

7 FVIII-VWF FVIIIa FVIII VWF N N C C S-S S-S IIa, FXa Vlot et al., 1998
A A2 FVIIIa C C A3 IIa, FXa 372 A2 FVIII 740 A1 C1 A3 B VWF C2 1689 N N C C S-S S-S Vlot et al., 1998

8 FVIII/VWF - Propiedades
Adhesión Endotelio/Sub Transporta FVIII Clínica Hemofilia vWD Producción S. Hepáticos C. Endoteliales Megacariocitos Gen Cromosoma X Cromosoma 12 Molécula Heterodímero Multímero Función Coagulación Procofactor

9 FVIII/VWF - Nomenclatura
Factor VIII Antígeno FVIII:Ag Función FVIII Factor von Willebrand Proteína Madura VWF VWF:Ag Cofactor Ristocetina VWF:RCo Unión al Colágeno VWF:CB Unión al Factor VIII VWF:FVIIIB ISTH

10 HEMOFILIA A Recesiva Ligada al sexo (gen FVIIICr X) PORTADORA
HEMOFILICO

11 HEMOFILIA Modo de Herencia

12 HEMOFILIA Modo de Herencia

13

14 HEMOFILIA Diagnóstico “sencillo”
- APTT prolongado - FVIII disminuido

15 HEMOFILIA - Clasificación
Severa < 1% VIII Moderada 1-5% VIII Leve >5% VIII

16 HEMOFILIA Diagnóstico de Portadoras

17 PORTADORA OBLIGADA Padre hemofílico Hijo hemofílico y antecedentes
(vía materna) 2 o más hijos, sin antecedentes familiares No requiere estudio

18 PORTADORA POTENCIAL Hijo hemofílico, sin antecedentes familiares
Sin hijos y con antecedentes (vía materna) Dificultad diagnóstica

19 PORTADORAS Lyonización
Ovulo Fertilizado Heterocigota Clones XM XP XP XM XM XP XP XM XP XM XM XP XM XP

20 PORTADORAS HEMOFILIA Factor VIII Portadoras Normales probabilidad
FVIII

21 Bioensayos DESVENTAJAS Probabilidad Error por lyonización extrema

22 Análisis de ADN VENTAJAS Certeza Independiente de lyonización

23 Análisis de ADN Alteración heterogénea Afecta diferentes regiones
Complejo Alteración heterogénea Afecta diferentes regiones del gen No aplicable a todos los casos

24 IDENTIFICACION INDIRECTA
No Certeza Análisis de segregación de RFLP ? -/ /- PORTADORA (-) asociado al defecto

25 50% hemofílicos severos
IDENTIFIACION DIRECTA Certeza Inversión del intrón 22 ↓ 50% hemofílicos severos

26 IDENTIFIACION DIRECTA
Inversiones Deleciones Inserciones Mutaciones “sin sentido” Mutaciones “sentido falso”

27 HEMOFILIA B Recesiva Ligada al sexo (gen FIXCr X) PORTADORA
HEMOFILICO

28 HEMOFILIA - Clasificación
Severa < 1% IX Moderada 1-5% IX Leve >5% IX

29 HEMOFILIA B Diagnóstico “sencillo”
- APTT prolongado - FIX disminuido

30 Propéptido Subunidad Madura
protómero dominios funcionales ligandos Factor von Willebrand Propéptido Subunidad Madura I S D D2 D’ D3 A1A2A3 D4BC1C2 S I D’ D A1A2A3 D4BC1C2 S I RGD Colágeno GPIIb-IIIa FVIII GPIb Heparina Heparina Colágeno Sulfátidos

31 VWD Clasificación Revisada Sadler E, 1994
Tipo 1 Deficiencia cuantitativa parcial Tipo 2 Alteración cualitativa Tipo 3 “Ausencia”de VWF

32 VWF Cromosoma 12 (12p1212pter)
VWD Genética VWF Cromosoma (12p1212pter)

33 VWD – TIPOS Frecuencia (%)
Tuddenham (134) 75 19 6 Lenk (111) 76 12 Nilson (106f) 70 10 20 Hoyer (116) 71 23 Awidi (65) 59 29,5 11,5 Berliner (60) 62 9 29 Castaman G, 2003

34 VWD Serie 1885 Pacientes FVIII 61,6% VWF:Ag 62,2% TS 58,4%
(Tipo I 91% ) FVIII 61,6% VWF:Ag 62,2% TS 58,4% Woods AI, 2001

35 Modificadires Ambientales Enfermedad primariamutación
VWF Expresión Variable Penetrancia Incompleta Chance Modificadires Ambientales edad, género, trauma Enfermedad primariamutación ? Genes modificadores Niveles Variables VWF Difícil Diagnóstico Ginsburg D, 2001

36 VWF-Variabilidad Individual Familiar

37 VWF-Variabilidad Factores 40% no genéticos 60% genéticos

38 VWF-Variabilidad Factores no-genéticos Edad Estrés Ejercicio
H. Tiroideas Estrógenos F.Aguda

39 VWF-Variabilidad Factores genéticos Grupo ABO  20-30% variabilidad
Grupo “O” VWF Hipótesis Glicosilación Alteración procesamiento estabilidad secreción

40 VWD Distribución según grupo ABO “AB” 0,6%  difícil diagnóstico
“O” 70%  más sintomático > frecuencia de consulta Woods AI, 2001

41 VWF Pruebas Específicas
Cuantitativa Cualitativa VWF:Ag SI NO VWF:RCo SI SI VWF:CB SI SI Multímeros SEMI SI

42 VWF-ELISA 1 2 3 4 1. Anti-VWF inmovilizado
a-vWF vWF a-vWF-HRP Color-Abs 2. Incubación con muestra o control 1. Anti-VWF inmovilizado 3. Incubación con anti-VWF-conjugado 4. Incubación con sustrato cromogénico

43 VWF:RCo Plaquetas normales Plasma del paciente

44 Agregación c/Ristocetina
VWF:RCo Plaquetas normales Plasma del paciente Ristocetina Agregometría Agregación c/Ristocetina

45 Agregación c/Ristocetina
VWF:RCo Plaquetas normales Plasma del paciente Ristocetina Agregometría Agregación c/Ristocetina PRP Plaquetas del paciente Plasma del paciente

46 Agregación c/Ristocetina
VWF:RCo Plaquetas normales Plasma del paciente Ristocetina Agregometría Agregación c/Ristocetina PRP Plaquetas del paciente Plasma Ristocetina Agregometría

47 Agregación c/Ristocetina
Normal Agregación c/Ristocetina vWD-Tipo 1 vWD-Tipo 2A vWD-Tipo 3 Kasper C, 2005

48 VWF:CB Unión Colágeno 1 2 3 4 1. Inmovilización 5 6 2. Bloqueo
Colágeno Tipo III BSA 3 a-vWFconejo Muestra 4 Esferas poliestireno IgG F(ab’)2* 1. Inmovilización 5 6 2. Bloqueo 3. Colágeno  VWF Citometría de flujo 4. VWF  a-VWF 5. a-VWF  IgGF(ab’)2fluoresceína 6. Adquisición

49 Actividad VWF-ELISA a-vWF vWF a-vWF-HRP Color-Abs 1. AcMo a-vWFepitope funcional inmovilizado 2. Incubación con muestra o control 3. Incubación con anti-vWF-conjugado 4. Incubación con sustrato cromogénico

50 Agregación c/Ristocetina
Kasper C, 2005

51 VWF-Análisis Multimérico
grandes intermedios-pequeños (banda 1) (banda 2) Línea Línea Línea 3 Lane 3> 2B Normal 2A

52 vWD-Tipo 2 Clasificación Revisada Sadler E, 1994
2A  función plaquetaria  Multímeros APM 2M  función plaquetaria c/Multímeros APM 2N  afinidad VWF-FVIII* *símil Hemofilia A, autosómica 2B  afinidad VWF-GPIb-IX

53 Propéptido Subunidad Madura
protómero dominios funcionales ligandos Factor von Willebrand Propéptido Subunidad Madura I S D D2 D’ D3 A1A2A3 D4BC1C2 S I D’ D A1A2A3 D4BC1C2 S I X RGD Colágeno GPIIb-IIIa FVIII GPIb Heparina Heparina Colágeno Sulfátidos

54 VWF:FVIIIB Enlace FVIII  VWF
a-vWF vWF FVIII Color-Abs CaCl2 0,4M 1. Anticuerpo a-vWF inmovilizado 2. Incubación con muestra o control 3. Incubación FVIII purificado/CaCl2 4. Incubación con sustrato cromogénico

55 VWF:FVIIIB Enlace FVIII  VWF
-3.50 -3.25 -3.00 -2.75 -2.50 -2.25 -2.00 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 Referencia Paciente 1 Paciente 2 Absorbancia 405nm

56 2N-Variante Normandy Biología Molecular. -. Secuenciación. -. Enz
2N-Variante Normandy Biología Molecular - Secuenciación - Enz. restricción

57 VWF- Arg19Trp (C2594T) Exón 18 Enzima BspMI Mutación Normal
1-244 pb pb pb Normal pb 96 pb Mutado pb 1 2 3 Mutación Normal

58 Screening VWD Estrategia Diagnóstica * T. Sangría APTT (fVIII)
Adhesividad Tiempo de obstrucción (PFA) *no permiten excluir VWD

59 Diagnóstico VWD Estrategia Diagnóstica -VWF plasma/plaquetas
VWF:Ag VWF:RCo VWF:CB -FVIII en plasma

60 Clasificación VWD Estrategia Diagnóstica Multímeros RIPA
Unión GP plaquetarias VWF:FVIIIB Biología Molecular

61 vWD- Importancia Dignóstica
VWF:RCo Prueba más sensible VWF:Ag CorrelacionaVWF:RCo Ratio=1Tipo1 Ratio<1Tipo2 FVIII Util para el manejo clínico T. Sangría CorrelacionaVWF:RCo (T1) Detecta defecto plaquetario RIPA Detecta Tipo 2B Castaman G, 2003

62 vWD- Importancia Dignóstica
A.Multimérico DiscriminaTipo 2M, 2A, 2B VWFplaquetario Predice respuesta DDAVPTipo 1 VWF:FVIIIB DetectaTipo 2N VWF:CB CorrelacionaVWF:RCo (T1) Sensibilidad  colágeno CT PFA-100 Especificidad (?) Castaman G, 2003

63 HEMOFILIA VON WILLEBRAND Diagnóstico Diferencial

64 Enfermedad de von Willebrand
Cofactor de ristocetina * Antígeno de factor vW  o N Factor VIII  o N Tiempo de Sangría  o N *excepto la variante 2N

65 Hemofilia Cofactor de ristocetina N Antígeno de factor vW N
Factor VIII  Tiempo de Sangría N

66 Hemofilia-VWD 2N Hemofilia VWD2N VWF:RCo N N Factor VIII  
VWF:FVIIIB N 

67 VWD Laboratorio Diagnóstico Control de terapéutica

68 COAGULPATIAS Orientación Diagnóstica

69 PRUEBAS V. INTRINSECA TTPA V. EXTRINSECA TP V. FINAL TT FC XII XIIa
XI XIa Ca2+ V. EXTRINSECA TP X Xa Va FL Ca2+ FT VIIa Ca2+ IX IXa VIIIa FL Ca2+ Fibrinógeno M. Fibrina Fibrina V. FINAL TT II IIa XIIIa Activación

70 INTERPRETACION Pruebas DEFECTO (probable) ↑TP, APTT, TT ↑APTT, TS  TP
APTT, TT, TS Normales V. Extrínseca (FVII) Déficit de factores Vit K Dep. Hepatopatía TP, APTT TT, TS Normales V. Común, Déficit de factores Vit K Dep., Hepatopatía TP, APTT, TT, TS Hepatopatía, CID ↑TP, APTT, TT TS Normal V. Final Fibrinógeno APTT TP, TT, TS Normal V. Intrínseca (FVIII, FIX, FXI, FXII) Hemofilia, VWD ↑APTT, TS TP, TT Normales VWD

71 INTERPRETACION Pruebas DEFECTO (probable) ↑TP, APTT, TT ↑APTT, TS  TP
APTT, TT, TS Normales V. Extrínseca (FVII) Déficit de factores Vit K Dep. Hepatopatía TP, APTT TT, TS Normales V. Común, Déficit de factores Vit K Dep., Hepatopatía TP, APTT, TT, TS Hepatopatía, CID ↑TP, APTT, TT TS Normal V. Final Fibrinógeno APTT TP, TT, TS Normal V. Intrínseca (FVIII, FIX, FXI, FXII) Hemofilia, VWD ↑APTT, TS TP, TT Normales VWD

72 INTERPRETACION Pruebas DEFECTO (probable) ↑TP, APTT, TT ↑APTT, TS  TP
APTT, TT, TS Normales V. Extrínseca (FVII) Déficit de factores Vit K Dep. Hepatopatía TP, APTT TT, TS Normales V. Común, Déficit de factores Vit K Dep., Hepatopatía TP, APTT, TT, TS Hepatopatía, CID ↑TP, APTT, TT TS Normal V. Final Fibrinógeno APTT TP, TT, TS Normal V. Intrínseca (FVIII, FIX, FXI, FXII) Hemofilia, VWD ↑APTT, TS TP, TT Normales VWD

73 INTERPRETACION Pruebas DEFECTO (probable) ↑TP, APTT, TT ↑APTT, TS  TP
APTT, TT, TS Normales V. Extrínseca (FVII) Déficit de factores Vit K Dep. Hepatopatía TP, APTT TT, TS Normales V. Común, Déficit de factores Vit K Dep., Hepatopatía TP, APTT, TT, TS Hepatopatía, CID ↑TP, APTT, TT TS Normal V. Final Fibrinógeno APTT TP, TT, TS Normal V. Intrínseca (FVIII, FIX, FXI, FXII) Hemofilia, VWD ↑APTT, TS TP, TT Normales VWD

74 INTERPRETACION Pruebas DEFECTO (probable) ↑TP, APTT, TT ↑APTT, TS  TP
APTT, TT, TS Normales V. Extrínseca (FVII) Déficit de factores Vit K Dep. Hepatopatía TP, APTT TT, TS Normales V. Común, Déficit de factores Vit K Dep., Hepatopatía TP, APTT, TT, TS Hepatopatía, CID ↑TP, APTT, TT TS Normal V. Final Fibrinógeno APTT TP, TT, TS Normal V. Intrínseca (FVIII, FIX, FXI, FXII) Hemofilia, VWD ↑APTT, TS TP, TT Normales VWD

75 INTERPRETACION Pruebas DEFECTO (probable) ↑TP, APTT, TT ↑APTT, TS  TP
APTT, TT, TS Normales V. Extrínseca (FVII) Déficit de factores Vit K Dep. Hepatopatía TP, APTT TT, TS Normales V. Común, Déficit de factores Vit K Dep., Hepatopatía TP, APTT, TT, TS Hepatopatía, CID ↑TP, APTT, TT TS Normal V. Final Fibrinógeno APTT TP, TT, TS Normal V. Intrínseca (FVIII, FIX, FXI, FXII) Hemofilia, VWD ↑APTT, TS TP, TT Normales VWD

76 INTERPRETACION Pruebas DEFECTO (probable) ↑TP, APTT, TT ↑APTT, TS  TP
APTT, TT, TS Normales V. Extrínseca (FVII) Déficit de factores Vit K Dep. Hepatopatía TP, APTT TT, TS Normales V. Común, Déficit de factores Vit K Dep., Hepatopatía TP, APTT, TT, TS Hepatopatía, CID ↑TP, APTT, TT TS Normal V. Final Fibrinógeno APTT TP, TT, TS Normal V. Intrínseca (FVIII, FIX, FXI, FXII) Hemofilia, VWD ↑APTT, TS TP, TT Normales VWD

77 Gracias