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Explicación de TPs Nº 1 y 2 Herencia y técnicas de biología molecular utilizadas en el diagnóstico de enfermedades hereditarias Química Biológica Patológica.

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1 Explicación de TPs Nº 1 y 2 Herencia y técnicas de biología molecular utilizadas en el diagnóstico de enfermedades hereditarias Química Biológica Patológica Bioq. Mariana L. Ferramola

2 Dogma central de la biología molecular: El ADN es la molécula responsable de contener toda la información genética de un ser vivo.

3 Nomenclatura de los cromosomas:

4 Genética Mendeliana: Fraile Gregor Johann Mendel Considerado el padre de la genética, estudió el genotipo y el comportamiento de los genes en las distintas generaciones de guisantes a partir de su fenotipo.

5 Conceptos básicos en genética: Gen Alelo Locus (loci) mutación Genotipo Fenotipo Desórdenes genéticos Cromosómicos. Monogénicos o mendelianos. Multifactoriales.

6 Formas de herencia de los trastornos monogénicos: Autosómica.Ligada al cromosoma X. El gen afectado se localiza en un autosoma. En general, estos trastornos afectan por igual a hombres y mujeres. El gen afectado se localiza en el cromosoma X. La incidencia en hombres y mujeres es diferente, dependiendo de si es de herencia recesiva o dominante.. Un trastorno monogénico es aquel que está determinado principalmente por los alelos localizados en un único locus.

7 Formas de herencia de los trastornos monogénicos: Patrones de herencia autosómica recesiva. Patrones de herencia autosómica dominante. Los individuos de ambos sexos tienen una probabilidad similar de presentar el trastorno. En la mayoría de los casos, los padres de un individuo afectado son portadores asintomáticos de alelos mutantes. Un hijo de padres heterocigotas presenta un 25% de probabilidades de presentar el trastorno. Los padres de personas afectadas suelen presentar consanguinidad. Se presenta típicamente alternando generaciones en el árbos genealógico. Los individuos de ambos sexos tienen una probabilidad similar de presentar el trastorno. Al menos uno de los padres del individuo afectado debe presentar el rasgo. Cada hijo con un progenitor afectado presenta un riesgo del 50% de heredar el trastorno. Los individuos fenotípicamente normales no transmiten el trastorno a sus hijos. Se presenta en todas las generaciones del árbol genealógico.

8 Formas de herencia de los trastornos monogénicos: Herencia dominante incompleta: La existencia de individuos afectados por trastornos dominantes con genotipo AA es teórica. Los individuos con dicho genotipo, en general, no son viables.

9 Formas de herencia de los trastornos monogénicos: Patrones de herencia recesiva ligada al X. Patrones de herencia dominante ligada al X. La incidencia del rasgo es mucho mayor en hombres que en mujeres. Los hombres afectados no transmiten el gen a sus hijos varones, pero si a todas sus hijas mujeres. Están afectados los varones hemicigotos y las mujeres homocigotas. En un emparejamiento entre un hombre afectado y una mujer sana, todos los hijos serán sanos y todas las mujeres afectadas. Una mujer heterocigota afectada transmitirá el rasgo a la mitad de sus hijos, estando igualmente afectados los varones y mujeres. La frecuencia de mujeres afectadas es aproximadamente el doble de la correspondiente a los hombres afectados.

10 Variación genética: mutación y polimorfismo.

11 Mutaciones: Cualquier cambio en la secuencia de un nucleótido o en la organización del DNA Genómicas Cromosómicas Génicas Mutaciones No todas las mutaciones tienen consecuencias clínicas

12 Tipos de mutaciones génicas: Deleciones e inserciones Pequeñas (pueden producir corrimiento del marco de lectura). Grandes (afectan la estructura génica). Sustituciones de nucleótidos Mutaciones de cambio de sentido Mutaciones sin sentido Mutaciones dinámicas Amplificación de secuencias repetidas de trinucleótidos

13 Polimorfismos: Son aquellas variantes alélicas tan comunes que se encuentran en una frecuencia mayor al 1% en la población general. Aplicaciones: Forenses Filiación Medicina

14 Tipos de polimorfismos: SNPs SNPs Son los más sencillos y frecuentes. En general existen solo dos alelos en la población. El hecho de que los SNPs sean comunes no implica que sean neutrales.

15 Tipos de polimorfismos: de inserción-deleción Polimorfismos de inserción-deleción Aproximadamente el 50% son simples (tienen 2 alelos en la población) El otro 50% son multialélicos. Clasificación: Microsatélites (STR) Minisatélites (VNTR)

16 Polimorfismos de inserción-deleción: STRs Segmentos de DNA que consisten en unidades de 2, 3 o 4 nucleótidos, cuya repetición varía entre una y unas pocas docenas de veces. Son multialélicos. Muy usados en la actualidad para identificación de individuos.

17 Polimorfismos de inserción-deleción: STRs Gel de poliacrilamida Amplificación por PCR

18 Polimorfismos de inserción-deleción: VNTRs Segmentos de DNA que consisten en unidades de 10 a 100 nucleótidos, cuya repetición varía entre unos cientos y miles de veces. Son multialélicos.

19 Polimorfismos de inserción-deleción: VNTRs Detección por autorradiografía Separación de fragmentos en geles de agarosa

20 Tipos de polimorfismos: de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP). Se deben a cambios en la secuencia del DNA que modifican los patrones de corte de las endonucleasas de restricción. Han sido muy utilizados como marcadores genéticos, es decir para determinar la presencia/ausencia de una enfermedad/alelo mutado en individuos.

21 RFLP: detección mediante Southern Blotting Utiliza una sonda que hibrida en una región conocida, pero no tiene relación con la mutación que produce el trastorno. De gran utilidad cuando no se conoce la mutación que produce el trastorno. Permite el seguimiento de alelos mutados dentro de una misma familia. Para su utilización, el polimorfismo y el gen a estudiar deben estar ligados (separados por una distancia no mayor a 10 6 pb)

22 RFLP: detección mediante Southern Blotting

23 RFLP: PCR-RFLP Más simple y económico que el RFLP tradicional. Se requiere mayor información de la zona donde ocurre la mutación. Generalmente es la mutación que genera el trastorno la que da lugar al polimorfismo.

24 RFLP: PCR-RFLP

25 Métodos de análisis de los ácidos nucleicos.

26 Conceptos básicos en biología molecular: Electroforesis Hibridación Sonda Endonucleasas de restricción Ligación Polimerasas Cebadores Transferasas

27 Endonucleasas de restricción: Son enzimas que cortan la molécula de DNA doble cadena (dsDNA) en lugares definidos por la secuencia de nucleótidos, produciendo fragmentos de DNA definidos.

28 Endonucleasas de restricción: Cuando se somete un fragmento de DNA a restricción con una endonucleasa, esta genera fragmentos definidos, que dependen del patrón de corte de la enzima.

29 Separación de ácidos nucleicos mediante electroforesis en gel:

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31 Geles de poliacrilamida Alta resolución. Separan fragmentos de DNA <500pb. Geles de agarosa Baja resolución. Separan fragmentos de DNA de entre 300 a 10000pb.

32 Sondas de ácidos nucleicos: Molécula de DNA o RNA marcada, usada para identificar secuencias complementarias mediante hibridación. Marcación de sondas Interna Externa Radiactiva No radiactiva

33 Marcación de sondas de ácidos nucleicos: DNA polimerasas Marcación interna: Desplazamiento de mella (*dNTP). Random primer extension (*dNTP o *cebador). Automatizada Sondas de oligonucleótidos (*dNTP).

34 Marcación por desplazamiento de mella: Nick translation.

35 Marcación por elongación de cebadores aleatorios: random priming.

36 Marcación de sondas de ácidos nucleicos: Polinucleótido quinasa Marcación Externa: Marcación con 32 P en extremo 5,utiliza γ[ 32 P]-ATP. Marcación no radiactiva. Transferasa terminal Marcación con 32 P en extremo 3, utiliza α[ 32 P]-ATP. Marcación no radiactiva.

37 Marcación externa: Polinucleótido quinasa

38 Marcación externa: Transferasa terminal.

39 Marcación de sondas de ácidos nucleicos:

40 Formas de marcación de sondas de ácidos nucleicos:

41 Hibridación de ácidos nucleicos: Las hebras complementarias de ácidos nucleicos pueden separarse (desnaturalización) y dadas las condiciones adecuadas pueden re asociarse (hibridación).

42 Hibridación de ácidos nucleicos: Factores que afectan la velocidad y especificidad de hibridación: Longitud del acido nucleico. Composición de base. Fuerza iónica. Viscosidad. Temperatura Presencia de agentes desnaturalizantes. pH

43 Hibridación con sondas de ácidos nucleicos: Las reacciones de hibridación con sondas de DNA son tan sensibles y selectivas que pueden usarse para detectar secuencias complementarias cuya concentración sea incluso de 1 sola molécula por célula. Hibridación: Rigurosa (bajo condiciones astringentes). Poco rigurosa (bajo condiciones no astringentes). Longitud de una sonda: Desde 5 hasta miles de nucleótidos

44 Hibridación con sondas de ácidos nucleicos:

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46 Métodos de análisis de ácidos nucleicos que utilizan sondas. Transferencia Southern Transferencia Northern Dot Blot Análisis de DNA. Análisis de RNA. Revelado mediante sondas ASO.

47 Transferencia Southern: Se utiliza para analizar fragmentos de DNA generados por digestión con enzimas de restricción.

48 Transferencia Southern:

49 Principales usos: Detección de secuencias relacionadas ( ej. familias de genes). Detección de deleciones e inserciones grandes causantes de enfermedades (ej. Distrofia muscular de Duchenne). Identificación de individuos mediante VNTR. Detección de RFLP. Se utilizan sondas de gran tamaño, con grados de actividad variable, dependiendo del uso.

50 Transferencia Northern: Se utiliza para analizar fragmentos de RNA obtenidos a partir de extracción.

51 Transferencia Northern:

52 Se utilizan sondas de tamaño intermedio. Esta técnica permite estudiar la expresión génica celular. Actualmente esta técnica ha caído en desuso, debido a la utilización de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

53 Comparación entre transferencias Northern y Southern:

54 Dot Blot: Se utiliza para detección de mutaciones puntuales, principalmente aquellas que no modifican el patrón de restricción de una secuencia de nucleótidos. Revelado: Sondas ASO Condiciones de hibridación de elevada astringencia.

55 Dot Blot:

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58 Métodos de análisis de ácidos nucleicos: PCR. Es la amplificación enzimática de un fragmento de interés (DNA) localizado entre dos oligonucleótidos (cebadores). Permite generar cantidades ilimitadas de una secuencia de interés.

59 Métodos de análisis de ácidos nucleicos: PCR. 94ºC Tm Primers 72ºC

60 Métodos de análisis de ácidos nucleicos: PCR. Primer Forward Primer Reverse

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62 Pérdida de eficiencia de PCR: Efecto Pasteur Factores que llevan a la pérdida de eficiencia de PCR: Disminución de actividad de la polimerasa. Disminución de la disponibilidad de dNTPs y cebadores. Disminución de la disponibilidad de Mg 2+, para el funcionamiento de la enzima.

63 Clases de PCR. PCR-semicuantitativa PCR-cuantitativa (PCR-en tiempo real) RT-PCR PCR-multiplex. PCR-anidada. PCR-aleloespecífica. PCR-mutagénesis dirigida.

64 Métodos de análisis de ácidos nucleicos: Secuenciación enzimática. Se lleva a cabo una reacción de amplificación del DNA en presencia de los cuatro dNTPs y concentraciones mucho menores de los cuatro análogos ddNTPs, que dan lugar a la terminación de la síntesis cuando son incorporados. Resolución de bandas en geles de poliacrilamida

65 Métodos de análisis de ácidos nucleicos: Secuenciación enzimática.

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67 Métodos de análisis de ácidos nucleicos: Secuenciación automática.


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