Proteínas Bioquímica, CHEM 4220 Universidad Interamericana de PR Recinto de Bayamón Prof. J. Roberto Ramirez Vivoni Prof. Alberto L. Vivoni Alonso Versión 2014

Funciones de proteínas Enzimas Anticuerpos de transporte Regulatorias Estructurales de movimiento

Clasificación de proteínas Globulares - estructura tridimensional. Ej. Enzimas, hemoglobina, insulina, caseina Fibrosas –estructuras de 1 ó 2 dimensiones (fibras o láminas) Ejemplos: queratinas (pelo, uñas), miosinas (músculos), colágeno (tejido conectivo) Conjugadas – Contienen grupos prostéticos (un grupo no-amino adicional) Transmembranales– atraviesan la membrana celular Glucoproteínas - Se encuentran en la membrana y actuan en reconocimiento y secreción Lipoproteínas – complejos tipo micelas que transportan triglicéridos y colesterol en la sangre.

Levels of structure

Angulos f y y

Ramachandran Plots

Preguntas Cuando f = 180° y y = 0°, ¿qué grupos tendrían interferencia estérica? ¿Se esperaría que una hélice “right handed” fuese estable con ángulos f y y de -57° y -47° respectivamente? ¿Y si fuesen 82° y -105°?

Láminas plegadas b: paralelas y anti-paralelas

Puentes de hidrógenos de láminas b

Hélices a

Puentes de H en hélices a

Características estructurales de las hélices a El oxígeno de cada carbonilo está unido por puente H con un H amído que queda 4 aminoácidos alejado. Cada vuelta cubre 5.4 Å, y posee 3.6 aminoácidos. Los grupos R quedan hacia afuera.

Cálculo de hélice a Determine la longitud (en Angstroms*) de una pieza con contiene 8 aminoácidos. *1 Angstrom = 10-10 metros

Estructuras 2°: helice, láminas y conectores

Ejemplo de proteínas fibrosas: colágeno

Características estructurales de colágeno Repetición de -Gly-X-Y- Gly y Pro componen aproximadamernte 30% y 20% respectivamente Cada vuelta de la hélice cubre 0.94 nm y posee 3.0 aminoácidos. Pregunta: ¿Cuántos aminoacidos hay 3.2 nm de longitud de una hélice de colágeno?

Estructura 3° de mioglobina

Estructura 4° de Hemoglobina

Posición de los aminoácidos en las estructuras de proteínas Se encuentran hacia la superficie de las proteínas Se encuentran hacia el centro de las proteínas Favorecen formación de helices a Desfavorecen la formación de helices a Favorecen la formación de laminas b Se encuentran en alto porcentaje en proteínas fibrosas Polares y con carga No-polares Sin carga, hidrofóbicos: Ala, Leu, Met, Val, Phe Pro, Gly, Tyr, Asn, Trp, Ile cadenas laterales con carga, voluminosas y contínuas Cadenas laterales pequeñas: Gly, Ala Gly, Pro, Ala

Preguntas A pH 7.4, en qué parte (centro o superficie) de una proteína globular se encontrarían los siguientes residuos: Ser, Glu, Thr, Phe, His, Val, Asn, Leu, Cys. Prediga cual sería la estructura de polipéptidos con las siguientes segmentos repetitivos: a) Poli(Gly-Ala-Gly-Thr) b) Poli(Glu-Ala-Leu-His) 3. Explique porqué el polipéptido poli-L-Glu forma hélices a a pH 2 pero no a pH 7.

Termodinámica de Proteínas: Energía libre de Gibbs DG = DH – TDS Criterio de espontaneidad DG < 0: espontáneo DG > 0: no-espontáneo DG = 0; equilibrio

Relación entre DG, DH, DS y T Especifique las temperaturas a las que las siguientes combinaciones de DH y DS propiciarían procesos espontáneos. +DH -DH +DS -DS

Procesos termodinámicos de proteínas DH DS Doblamiento Solubilidad Dimerización Metabolismos Interacción ligando-receptor

DG y equilibrio Calcule K para una reacción de dimerización con los datos en la tabla y la ecuación: DG = -RTlnK 2 monómeros ↔ dímero T(°C) DH(kJ/mol) DS(kJ/mol) DG(kJ/mol) 4 1.0 -0.0361 24 -0.0074 45 0.0157

Fuerzas que mantienen estructuras 3° y 4° Fuerzas London (van der Waals) entre grupos R que son no-polares e hidrofóbicos. Puentes H entre grupos R polares. Puentes salinos entre AA de carga opuesta Puentes disulfuros entre cisteinas (cistina)

Desnaturalización de proteínas Temperatura pH solventes orgánicos y detergentes metales pesados estres mecánico

Efecto de temperatura Coagulación - cuando las hebras desnaturalizadas se entrelazan y se hacen insoluble

Efecto de temperatura en enzimas

Efecto de pH

Desnaturalización por ácido o base

Desnaturalización por alcohol

Desnaturalización por agentes reductores

Separacion/purificacion y caracterización Caracteristicas físicas Técnica experimental Tamaño Solubilidad Carga Polaridad Dialisis Filtración en gel Ultracentrifugación Espectrometría de masa Precipitación Electroforesis Intercambio iónico 4. Cromarografía de adsorción

Peso molecular Mr o MW (Molecular Weight): masa molecular relativa a 1/12 la masa de carbono (sin dimensiones) MM (Masa Molar): masa de de 1 mol (g) Masa Molecular: Masa actual en unidades de masa atomica (dalton: Da, kDa, 1 Da = 1.66x10-24 g)

Preguntas Se encontró que una proteína que contiene el grupo home es 0.426% Fe por peso. Cuál es su masa molecular mínima? Treonina constituye 1.8% por peso de contenido de aminoácido de insulina. Dado que la masa de treonina es 119 Da, cuál es la masa mínima de insulina? Una proteína contiene 0.326% por peso de Fe. Cuál es su masa molecular?

Masa aproximada De acuerdo a la proporción de aminoácidos en la mayoría de las moléculas, la masa promedio de un residuo es 110 Da. Cuál es la masa molecular aproximada de citocroma c el cual tiene 104 residuos?

Separacion por peso/tamaño Diálisis Filtración en gel

Pregunta ¿En qué orden emergerían las siguientes proteínas en una columna de filtración-gel cuya matriz de gel tiene poros de ~200,000: mioglobulina (Mr = 16,000), catalasa (Mr = 500,000), citocroma c (Mr = 12,000), quimotripsinógeno (Mr = 26,000) y hemoglobina (Mr=66,000).

Ultracentrífugación

Ultracentrifugación analítica Ecuación de Svedberg MM = RTs/D(1-m0) s: coeficiente de Svedberg (s) R: constante universal de gases (J/Kmol, J: kgm2/s2) T: temperatura (K) D: difusión (m2/s) m0: fracción de masa de solvente desplazada

Pregunta Calcula la masa de un proteína con los siguientes datos experimentales: s = 4.2 x 10-13 s D = 1.2 x 10-10 m2/s mo = 0.719

Solubilidad Control de precipitación: Controlando el pH: las proteínas son menos solubles cuando el pH del medio es igual a su pI Aumentando la polaridad del medio Aumentando la no-polaridad del medio

Electrophoresis* *pH dependent

Pregunta En qué dirección se moverían las siguientes moléculas en un campo eléctrico a los pH indicado? Albúmina (pI= 4.9) a pH 8.0 Ureasa (pI=5.0) a pH 3.0 y 9.0 Ribonucleasa (pI=9.5) a ph 4.5, 9.5 y 11.0 Pepsina ((pI=1.0) a pH 3.0, 7.0 y 9.5 Hemoglobina A tiene un pI = 6.9. Una variante, hemoglobina M, tiene un residuo de glutamato en la posición 67 en vez de valina. Qué efecto tiene esta sustitución en el comportamiento electroforético a pH 7.5.

Cromatografía Papel Capa fina Intercambio iónico Cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)

Intercambio iónico Intercambio anónico: intercambian aniones Intercambio catiónico: intercambian cationes

Pregunta Una solución de albumina de huevo (pI = 4.6), b-lactoglobulina (pI = 5.2) y quimotripsinógeno (pI = 9.5) se introducen a una columna de cromatografía de intercambio iónico compuesta de amonio con carga positiva a un pH de 5.4. La columna luego se eluyó con un amortiguador de 5.4 con un aumento en la concentración salina. ¿En qué orden saldrían estas proteínas de la columna y porqué?

Pregunta Ovalbúmina (pI=4.6), ureasa (pI=5.0) y mioglobina (pI=7.0) se agregan a una columna de intercambio iónico con una resina con carga positiva a un pH de 6.5. La columna luego se eluye con un amortiguador de 6.5 con un aumento en concentración de NaCl. En qué orden salen las proteínas de la columna?

Pregunta Cómo separaría una mezcla de 2 proteínas de 24 kDa con pI de 5.5 y 7.0 y otra de 100 kDa con un pI de 5.4.

Caracterización Peso molecular: Estructura: Espectrometría de masa Ultracentrigufugación analítica Estructura: Rayos X Resonancia magnética nuclear (“NMR”) Dichroismo circular

Otra proteína fibriosa Para una proteína con los siguientes porcientos de composición: Gly 45% Ala 30% Ser 12% Tyr 5% Val 2% Otros 6% Cual esperaría que fuese su estructura secundaria

Síntesis de proteínas por traducción

Representación de proteínas

Estructura de proteínas 4 niveles de complejidad o estructura. “proteína nativa” se refiere a una proteína con la estructura y forma en que funciona biológicamente en la célula.

Estructura primaria: terminal C y N

Hélice α Se forma un espiral de derecha, como un tornillo común. El oxígeno de cada grupo carbonilo está unido por puente H con un H amído que queda 4 AA alejado. Los muchos puentes H logran una estructura fuerte. Cada vuelta cubre 5.4Å, y posee 3.6 AA. Los grupos R quedan hacia afuera.

Hélice α

Hélice α vista desde arriba

Hélice α i

Lámina plegada β -hebras conectadas lateralmente por 5 o mas puentes H (tipico 5 a10) formando lámina torcida

Lámina plegada β anti-paralela

Anti-paralela y paralela

Lamina plegada

Lámina plegada β i

Estructura 3°: globulares y fibrosas

Explicación Est. 3°

Fortaleza de fuerzas intramoleculares en Kcal/mol Puente salino (enlace iónico) ~150 puente Hidrógeno 10-16 Fuerzas London < 1 Puente disulfuro (S-S) 60 Otros enlaces covalentes: C-N 65; C-C 80 ; C=C 145 ; C-H 98

Interacciones hidrofóbicas (London)

Puentes de hidrógeno

Puentes salinos

Puentes disulfuros (cistinas)

Est. 3°

Fuerzas intramoleculares

La conformación típica de la proteína en su ambiente celular se conoce como estado nativo o conformación nativa. Se asume que esta es la conformación mas estable termodinámicamente.

proteínas globulares La estructura terciaria determina la función biológica de la proteína. Mayormente los grupos R no-polares (hidrofóbicos) quedan en el interior de la estructura, unidos de cerca y lejos del agua. Grupos R polares y con carga quedan en la superficie. Son extremadamente compactas. Prolina interrumple la hélice y frecuentemente se encuentra en los conectores.

Tropocolágeno – triple hélice de izquierda, cada tercer AA es glicina

proteínas globulares o esferoproteínas son mas solubles en agua i

proteínas conjugadas En algunos casos la estructura cuaternaria de una proteína funcional incluye un grupo no-protéico. Este grupo se conoce como un grupo prostético. Ejemplos son el grupo “heme” en hemoglobina que carga oxígeno; grupos sacáridos en glucoproteínas que sirven de receptores en la superficie celular.

Grupo “heme” : porfirina con Fe

Definiciones i

Glucoproteína – oligosacárido unido por terminal N de asparagina

Glucoproteína transmembránica con oligosacáridos unidos a Asn, Thr o Ser

i

Desnaturalización de proteínas globulares Desnaturalización ocurre cuando las estructuras 2° y 3° se desorganizan y se pierde la forma nativa por ende su función. Temperatura pH solventes orgánicos y detergentes metales pesados estres mecánico

Desnaturalización