Estudio Virológico por PCR en tiempo real Diagnóstico Molecular de Herpes virus MSc. Mónica Cappetta Lab. Biología Molecular, AEPSM

Biología Molecular en la Clínica Los métodos moleculares han potenciado la capacidad de los laboratorios de identificar y caracterizar los agentes infecciosos en profundidad. Las aplicaciones incluyen: detección cualitativa y cuantitativa genotipado y detección de subtipos testeo de resistencia molecular Cuando se aplican estas metodologías selectivamente en un laboratorio se potencian los diagnósticos y el manejo clínico de los pacientes.

Agentes Virales Detección viral directa por amplificación de ác. nucleicos: - Eliminación en algunos casos de la utilización de métodos indirectos. - Eliminación del cultivo viral altamente complejo. - Rápido diagnóstico de infecciones virales. - Alta sensibilidad y especificidad

Familia Herpes virus Infección – latencia – reactivación Principal causa de enfermedad humana viral luego de la gripe. Infección – latencia – reactivación 25 tipos 8 infectan al hombre. Mayoría de población humana infectada; adultos en gral. con Ac para la mayoría de los herpes virus excepto HHV-8. Virus envueltos de ADN doble cadena. Se clasifican por su localización en el estado latente.

Propiedades de los virus Herpes humanos Tipo Nombre Sub Familia Células blanco Latencia Transmisión 1 Herpes simplex-1 (HSV-1) Alfaherpesvirinae Mucoepitelio Neurona Contacto cercano Contacto sexual Madre-bebé 2 Herpes simplex-2 (HSV-2) Contacto cercano Contacto sexual 3 Varicella Zoster virus (VSV) Contacto 4 Epstein-Barr Virus (EBV) Gamaherpesvirinae Linfocito B, epitelio Linfocito B Saliva, ruta respiratoria 5 Cytomegalovirus (CMV) Betaherpesvirinae Epitelio, monocitos, linfocitos Monocitos, linfocitos y otros Secreciones, transfusión sangre, transplan-te, congenita 6 Herpes lymphotropic virus Linfocitos T y otros Contacto, ruta respiratoria 7 Human herpes virus-7 (HHV-7) Desconocido 8 Human herpes virus-8 (HHV-8) Cél. endoteliales Intercambio de fluido corporales?  

Manifestaciones clínicas HSV 1 y 2: Lesiones VZV: varicela (niños) herpes zoster (adultos/react.) EBV: Asintomático (niños) Mononucleosis (jóvenes/adultos) CMV: asintomático Complicaciones Encefalitis (HSV, VZV) Neumonia (VZV) Linfomas luego de transplantes o SIDA (EBV) Infección congénita (VZV, CMV) Retinitis, neumonia, esofagitis, encefalitis en inmunodeprimidos (CMV)

Diagnóstico Molecular de Herpes virus Encefalitis virales : estudio de LCR Pacientes inmunodeprimidos

Herpes virus y encefalitis Agente causal de infecciones SNC (10% encefalitis virales) 70% tasa mortalidad diagnóstico precoz - terapia antiviral morbilidad/moratlidad 20% en Uruguay: 9% encefalitis viral por HSV Menos agresivo: Biopsia cerebro vs Punción LCR

Reactivación en inmunodeprimidos Ejemplo Citomegalovirus: Las pruebas serológicas presentan un uso limitado: - individuos con infección latente - anticuerpos aparecen 2 semanas después de la infección aguda Se produce la enfermedad al reactivarse como resultado de Inmunodepresión: ej transplantes, SIDA, etc. La detección del ADN del CMV en plasma permite detectar esta reactivación. Seguimiento de respuesta al tratamiento: carga viral.

LCR Orina Plasma Biopsia ADN PCR 1er. round 2do. round 2n copias DNA Producto nested-PCR Electroforesis en gel

Diagnóstico por real time-PCR Detección rápida. Detección cualitativa y cuantitativa. No requiere manipulación post-PCR. Menor probabilidad de contaminación o errores de manipulación.

Implementación en el laboratorio Detección cualitativa de familia Herpes virus en LCR por PCR en tiempo real: - Entrega de resultados en unas horas Cuantificación de CMV y EBV por PCR en tiempo real: - Seguimiento de pacientes con reactivación - Evaluación de tratamientos

Detección cualitativa de familia Herpes por Real time 3 Reacciones de amplificación: HSV / CMV EBV / HHV-6 VZV 6 diagnósticos en la misma corrida de amplificación. Detección por Sybergreen Tm específica Utilización de Uraciloglicosilasa durante la implementación en el laboratorio del protocolo. Multiplex

La Tm puede variar para: Identificación de productos de PCR por perfiles de Curvas de Melting La Tm depende de la secuencia del ADN, el largo del producto y el contenido de GC. La Tm puede variar para: - Prod. de igual tamaño pero distinto contenido de GC - Prod. de igual tamaño y %GC pero con una distribución de GC diferente - Productos que difieran en 1 o más bases. Análisis: Se monitorea la fluorescencia de la muestra mientras la T° aumenta. Se grafica la d/dT de la Fluorescencia en función de la Temp (°C).

Análisis de Tm de los productos amplificados VZV HHV6 EBV

Diagnóstico de Herpes virus: PCR vs PCR en tiempo real PCR 24-36 hrs 2-4 cicladores Alta manipulación Riesgo de contaminación Utilización de Kit comercial Costos más elevados

Diagnóstico de Herpes virus: PCR vs PCR en tiempo real PCR 24-36 hrs 2-4 cicladores Alta manipulación Riesgo de contaminación Áreas pre y post-amplificación físicamente separadas Cabina de UV

Diagnóstico de Herpes virus: PCR vs PCR en tiempo real 24-36 hrs 2-4 cicladores Alta manipulación Riesgo de contaminación PCR tiempo real 2-3 hrs LightCycler Poca manipulación Riesgo de contaminación Multiplex con Sybergreen Menor costo que Kit comercial

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