Detección de OGM en la Cadena Agroalimentaria Alumnos: Alegre, Rumesilda Eliana Dabrio, Alfredo Gauto, Silvana Monzón Dabrio, Agustina Silva, Carolina.

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1 Detección de OGM en la Cadena Agroalimentaria Alumnos: Alegre, Rumesilda Eliana Dabrio, Alfredo Gauto, Silvana Monzón Dabrio, Agustina Silva, Carolina Gisela Zacarías, Lilian Katia Genética

2 Según la Comisión Nacional Asesora de Biotecnología Agropecuaria (CONABIA), un Organismo Genéticamente Modificado (OGM) es: “un organismo al cual se le ha introducido, en forma deliberada y controlada, alguna modificación en su material genético haciendo uso de las técnicas modernas de biología molecular. Esta modificación consiste en incorporar información para conseguir que el organismo adquiera una determinada característica que antes no poseía”. Se denomina evento transgénico a un OGM caracterizado por un segmento específico de ADN nuevo que se ha insertado de manera definida y controlada en el genoma original.

3 Estrategia de análisis Ensayo cualitativo: determina la presencia o ausencia de una secuencia de ADN, de proteínas o fenotipo debido al transgén. Ensayo semi-cuantitativo: sub muestreo. La estrategia radica en el análisis de una determinada cantidad de grupos (N) de tamaño conocido de semillas o granos (m) y la estimación estadística del porcentaje de analítico presente en la muestra. Ensayos cuantitativos: se refiere a la determinación del porcentaje de OGM en una muestra o lote. Esto es posible debido a la metodología empleada y no a una estimación estadística.

4 Materiales Biológicos. Harinas o granos. Secuencias de ADN. Plásmidos.

5 Métodos 1.BIOENSAYOS: método cualitativo que consiste en la evaluación de la respuesta fisiológica de manera de determinar la presencia de transgén buscado. Ventaja: tolerancia a herbicidas. Sencillo, preciso y económico. Desventaja: demora para lectura de resultados. Costoso y complejo (resistencia a insectos).

6 Métodos. 2.DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS: método cualitativo o semi-cuantitativo, que se determina utilizando una reacción inmunológica de tipo proteína GM-anticuerpo. Ventajas: sencillo, rápido, preciso y exacto. Permite la detección “in situ”. Desventaja: no permite la identificación de cultivos distintos que presenten la misma proteína GM. Puede conducir a errores debido a las diferencias de los niveles de expresión de la proteína. PLACA (ELISA) 

7 Métodos. 3.DETERMINACIÓN DE SECUENCIAS TRANSGÉNICAS: se realiza mediante PCR. Proceso altamente especifico que permite determinar el evento transgénico que contiene una muestra. Los Primers se adhieren a:  Secuencias promotoras o terminadoras  Gen especifico  Región constructiva especifica  Evento especifico

8  Dos tipos: PCR tiempo final (cualitativo) PCR tiempo real (cuantitativo) Rápido. Mayor sensibilidad y especificidad. Reduce la posibilidad de contaminación. Permite la identificación y cuantificación especifica de eventos. Mayor costo en equipos y reactivos. El ADN amplificado se obtiene durante el proceso. Sensible, exacto y especifico. Permite la identificación especifica de eventos. Elevado costo Mayor posibilidad de contaminación. El ADN amplificado se obtiene al final.  Cuidado en el manipuleo de muestras: Cuatro aéreas separadas:  Preparación de la muestra  Extracción y purificación del ADN  Preparación de la reacción de PCR  Amplificación y electroforesis

9 -PCR en tiempo real: combina el uso de un TERMOCICLADOR, FLUORÍMETRO y ORDENADOR. TERMOCICLADOR: efectúa la PCR en condiciones donde un fluorocromo excitado por un láser va emitiendo una señal de manera proporcional a la cantidad de ADN que se va generando durante los sucesivos pasos de la reacción. FLUORÍMETRO: recibe la emisión de la señal fluorescente y cuantifica dicha señal. ORDENADOR: procesa la información y despliega, durante cada ciclo de amplificación, la fluorescencia leída en cada muestra.

10 4- NUEVAS METODOLOGÍAS: MICROCHIP o MICRORRAYS o MICROMATRICES: detecta y cuantifica en un solo ensayo la presencia de cientos o miles secuencias que tienen la capacidad de pegarse o hibridarse con un ADN complementario, y el punto de micromatriz quedara marcado. Ventajas: posibilita la detección simultánea de miles de secuencias de ADN distintas. Desventajas: costos elevados. Falta de referencias adecuadas para validación. Complejidad sobre los criterios a utilizar.

11 Resultados Se pueden obtener: Falsos negativos: reacciones para las que no se detectan proteínas o secuencias de ADN, cuando en realidad la contienen. Falsos positivos: reacciones para las que se detecta proteínas o secuencias de ADN cuando en realidad NO la contienen.

12 PRESENTACIÓN DE RESULTADOS: Cualitativos: -“No se detectó” (negativo) - “Se detectó la presencia de material GM o de la secuencia XX o proteína XXX en la muestra al límite de detección de la técnica” (positivo) Cuantitativos: -“menor al límite de detección de la técnica” (sin detección de analito) - valor numérico en porcentaje (detección de analito)

13 La Internacional Standarization Organization ISO(organización internacional de normalización) se ha ocupado de redactar normas especificas en el tema : Los organismos internacionales y la determinación de OGM 1.Protein Based Methods-2004 modificada en el 2005. (Métodos basados en proteínas) 2.Nucleic Acid Extraction -2005 (Extracción de ácido nucleico) 3.Qualitative Nucleic Acid Based Methods -2005 (métodos cualitativos basados en ácidos nucleicos) 4.Quantitative Nucleid Acid Based Methods -2005 (métodos cuantitativos basados en ácidos nucleicos) 5.General Requirements and Definitions-2006 (requisitos generales y definiciones) 6.Acceptability Criteria for Methods 2006 (criterios de aceptabilidad de métodos)

14 Publico en el año 2006 su estrategia para la determinación de semillas GM. Elabora una estrategia de acreditación de laboratorios para la detección de características específicas. Basada en el cumplimiento de una serie de requisitos técnicos, de capacitación, de desempeño y de la gestión por parte de los laboratorios. Reglas ISTA Asociación Internacional de Análisis en Semillas

15 La necesidad de monitorear, identificar y cuantificar la presencia o no de OGMs ha generado el desarrollo y la implementación de distintas herramientas analíticas para su detección, por lo cual los laboratorios tuvieron que desarrollar, adaptar y validar diferentes métodos. La aprobación de nuevos eventos plantea el desafío de la continua actualización y el desarrollo de nuevos métodos y sistemas para la determinación de OGMs en semillas, granos y alimentos. CONSIDERACIONES FINALES