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Publicada porRoberta Meno Modificado hace 10 años
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PCR Enrique Arce Sophie Ouabbou Mónica Penón Celina Vargas
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Generalidades PCR: Reacción de la cadena de polimerasa
Descrita en 1985 por Kary B. Mullis Objetivo: obtener mediante amplificación in vitro, cantidades “masivas” de ADN a partir de muestras de ADN Cuantitativo o cualitativo
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PCR cuantitativo Apoyo pronóstico
Cuantificar cargas virales: control terapéutico de virosis crónicas y pacientes inmunosuprimidos
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PCR cualitativo Genotipaje Apoyo diagnóstico
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¿Qué caracteriza al PCR y lo diferencia de otras técnicas moleculares?
Específico Sensible Exacto Preciso Resultados relativamente rápidos
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PROCEDIMIENTO
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Materiales y reactivos
Desoxinucleotidos trifosfato ( dNTPs). Primers , cada uno complementario a una de las dos hebras de ADN. Iones divalentes y monovalentes (cofactores de la polimerasa). Solución buffer (mantiene pH adecuado). ADN molde. ADN polimerasa. Termociclador.
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Pasos a seguir Paso 1: Desnaturalización por calor (>90°C). Se parte la doble cadena de ADN para que nucleótidos queden expuestos a la polimeraza. Paso 2: Hibridación del Primer (unión a su secuencia complementaria en el ADN molde) (40°C-65°C).
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Extensión con la DNA polimerasa (72 °C).
Paso 3: Extensión con la DNA polimerasa (72 °C). Actúa tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del Primer como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. ** Siempre se debe utilizar doble cadena de ADN, por lo tanto para virus hay que hacer primero un proceso de transcripción.
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Los Primers los hacen casas comerciales que estudian zonas muy bien conservadas de los virus.
La prueba debe estandarizarse: buscar la cantidad exacta de reactivos para obtener el producto exacto. Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto, se emplean técnicas de electroforesis.
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TÉCNICAS DE PCR
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Retrotranscriptasa PCR (RT-PCR)
In situ PCR Real time PCR PCR anidada Multiplex PCR End-point quantitative PCR Rapid cycle PCR
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Según el objetivo del examen, la prueba puede ser:
Cualitativa Cuantitativa
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VIH: RT-PCR Pasos Retrotranscripción Amplificación
La técnica de PCR se usa más para pronóstico de VIH que para diagnóstico.
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LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR DEL HOSPITAL SAN JUAN DE DIOS
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Referencia a nivel regional (Centroamérica) para pruebas diagnósticas de VIH.
En Costa Rica, es el único laboratorio haciendo cargas virales con propósito diagnóstico, el tratamiento y monitoreo de pacientes. Tienen la capacidad de analizar citomegalovirus, herpes, VIH, genotipos, entre otros.
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El laboratorio Para evitar la contaminación del material genéticodebenhaber al menos 2 áreas de trabajo, sin embargo el hospital cuenta con tres: 1. Extracción (el material genético de lasmuestras) 2. Amplificación (donde se lleva a cabo la PCR) 3. Detección (con secuenciador)
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1. Área de extracción Separar el AND o ARN de la célula de donde reside. Se pueden utIlizar muchas técnicas diferentes para este paso.
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2. Amplificación Ciclador automatizado que repite numerosas veces los cambios de temperatura para amplificar la carga viral de la muestra.
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3. Detección Secuenciador y detector.
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GRACIAS
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