NYSHON ROJAS 1, GLORIA MINAYA 1, AIDE SANDOVAL 1, OMAR CACERES 2 1 Laboratorio de Leishmaniosis - Instituto Nacional de Salud. 2 Laboratorio de Biotecnología.

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1 NYSHON ROJAS 1, GLORIA MINAYA 1, AIDE SANDOVAL 1, OMAR CACERES 2 1 Laboratorio de Leishmaniosis - Instituto Nacional de Salud. 2 Laboratorio de Biotecnología y Biología Molecular - Instituto Nacional de Salud. ANTECEDENTES La Leishmaniosis, enfermedad producida por parásitos del género Leishmania, se caracteriza por comprometer piel, mucosas o vísceras, dependiendo de la especie de Leishmania involucrada en la infección y de la respuesta inmune del hospedero, entre otros. En la actualidad se han desarrollado variaciones del PCR con el uso de fluoróforos como el SYBR Green para la identificación del género Leishmania, en un PCR en tiempo real; Nicolas, et al, diferenciaron las especies de L.(L.) mayor, L.(L.) infantum, L.(L.) tropica y L.(L.) donovani mediante el Análisis de Curvas de Melting en función a la concentración de GC/AT, la secuencia y el tamaño del producto amplificado; otros autores, utilizando también el fluoróforo SYBR Green en un PCR en tiempo real, con primers específicos para el complejo Viannia y para el complejo Leishmania, reportaron la diferenciación de estos sub-géneros, sin embargo, no lograron diferenciar las especies dentro del mismo complejo; asimismo, mediante un primer específico para L.(V.) braziliensis, no lograron diferenciarlo de L.(V.) peruviana. El diseño de estrategias adecuadas en el control y tratamiento diferenciado de la Leishmaniosis, requiere de la identificación rápida de las especies de Leishmania, haciéndose necesario el desarrollo de herramientas moleculares como el PCR en tiempo real.. MATERIAL Y MÉTODOS Se empleó cepas referenciales de Leishmania procedentes de cultivos en medio Schneiders: Leishmania (Viannia) braziliensis (04) MHOM/PE/84/LC53; MHOM/BR/84/LTB300; MHOM/BR/1975/M2903; MHOM/BR/1975/M2904; Leishmania (V.) peruviana (02) MHOM/PE/84/LC26; MHOM/PE/84/LC39; Leishmania (L) mexicana (02) MHOM/BZ/82/ Bel21; MNYC/BZ/62/M379; Leishmania (L.) amazonensis (02) MHOM/BR/1973/M2269; IFLA/BR/67/PH8 El DNA purificado fue llevado a un PCR en tiempo real, a una concentración de 5 ng/ul de DNA, 0.7 uM de los primers OL1 y OL2, en la reacción. Se emplearon 2 fluoróforos en forma independiente, se añadieron a la reacción en volumen de 1x de Sybr green (Quantitec Sybr green PCR Kit; Qiagen), el PCR consistió de 35 ciclos: denaturalización a 94°C x 15 seg., anillamiento a 55°C x 30 seg. y una extensión a 72°C x 30 seg., seguido por un incremento progresivo de 1°C de temperatura en el intervalo de 75°C a 95°C; para el fluoróforo Eva Green (Tipe-it HRM PCR kit; Qiagen), 35 ciclos: denaturalización a 95°C x 10 seg., anillamiento a 55°C x 30 seg. y una extensión a 72°C x 10 seg. seguido también por un incremento progresivo de 1°C de temperatura en el intervalo de 75°C a 95°C, para lograr la denaturalización de la doble cadena del amplicón y la disociación del fluoróforo. El análisis de las curvas de disociación para la diferenciación de especies de Leishmania, se realizó a un intervalo de confianza de 90% mediante el Rotor Gene Q software. PERÚMinisterio de Salud Instituto Nacional de Salud Centro Nacional de Salud Pública OBJETIVO Diferenciar especies de Leishmania spp. mediante el análisis de las curvas de disociación. CONCLUSIONES El Análisis de Disociación, por incremento de temperatura en PCR de tiempo real, es una herramienta potencial para la determinación de las especies de Leishmania infectantes, como se muestra en el presente trabajo, con cepas referenciales. Las diferentes especies de Leishmania presentan diversas curvas de discociación, por la resistencia del DNA a la denaturalización debido a la concentracion de A=T y GC, como se ha reportado en trabajos previos para la identificación de especies de Leishmania del viejo mundo por Análisis de Curvas Melting y Análisis de las curvas de disociación. El DNA, frente al incremento controlado de temperatura, presenta resistencia a la denaturalización, que es característico para cada especie, producto de la presencia de los puentes de hidrógeno entre los nucleótidos; en el presente trabajo se observa curvas de disociación comunes entre cepas de la misma especie, obtenidos mediante PCR en tiempo real, permitiendo la diferenciación de especies de Leishmania spp, en menor tiempo. La identificación de especies de Leishmania mediante esta metodología, requiere un análisis comparativo con una prueba Patrón de Oro en la identificación de especies de Leishmania en muestras clínicas, a fin de determinar su performance; dentro de las técnicas consideradas actualmente Patrón de Oro, están el Análisis Enzimático, Anticuerpos Monoclonales y el Secuenciamiento. Para la diferenciación de especies de Leishmania del sub-genero Viannia, se debe incluir cepas referenciales de Leishmania (V.) guyanensis, Leishmania (V.) pananemsis, Leismania (V.) lainsoni, por la diversidad de especies de Leishmania circulantes en el Perú; además, incluir cepas referenciales de Leishmania (L.) infantum y Leishmania (L.) chagasi, por estar implicados en la transmisión de Leishmaniosis Visceral, humana y canina, presentes en los países fronterizos de Brasil, Bolivia y Colombia. DIFERENCIACIÓN DE ESPECIES DE LEISHMANIA MEDIANTE PCR EN TIEMPO REAL RESULTADOS Las especies de Leishmania se diferenciaron mediante el análisis generado en el software del equipo Rotor-Gene Q, obteniendóse, indistintamente al kit empleado, curvas de disociación comunes entre cepas de la misma especie, formando 4 grupos diferenciados correspondientes a las cepas referenciales de Leishmania (V.) braziliensis, Leishmania (V.) peruviana, Leishmania (L.) mexicana y Leishmania (L.) amazonensis; además, estos pueden agruparse de acuerdo al valor Tm entre las cuatro especies. Figura N°01: Diferenciación de especies de Leishmania mediante PCR en tiempo real, con el fluoróforo Eva Green (Tipe-it HRM PCR kit; Qiagen). Figura N°02: Diferenciación de especies de Leishmania mediante PCR en tiempo real, con el fluoróforo Sybr Green (Quantitec Sybr green PCR Kit; Qiagen).