Derivatización de Analítos Métodos Cromatográficos Universidad Autónoma de Yucatán Maestría en Ciencias Químicas y Bioquímicas Presentado por: IQI Ulises Gracida Álvarez

Definición Es el proceso que consiste en modificar químicamente un compuesto para producir un derivado con nuevas propiedades que faciliten o permitan su análisis. Mejora la volatilidad, estabilidad térmica y la detección del analito. En este tipo de reacciones no se conoce la estructura de los productos. Es la reacción en si misma la que da la estructura de los derivados.

Características Condiciones de operación lo más simples posible. Número mínimo de etapas (no más de dos). Rendimiento máximo de la reacción y que sea reproducible. El origen químico de los productos formados debe ser predecible. Correspondencia entre el número inicial de analitos y sus derivados. Se deben notar las características de la terminología estructural de los derivados. La información previa al análisis provenga de características generales de las reacciones de derivatización.

Tipos de derivatización Sililación Reemplazo de un hidrógeno ácido con un grupo alquilsililo Acilación Conversión de compuestos con hidrógenos activos como –OH, -SH, y –NH en esteres, tioesteres y aminas, respectivamente. Alquilación Reemplazo de un hidrógeno activo en R-COOH, R-OH, R-SH, R-NH 2 con un grupo alquilo o arilo.

Aplicaciones generales Transformación de compuestos no volátiles en derivados volátiles. Conversión de compuestos no detectables en productos apropiados por minimización del límite de detección. Análisis de compuestos reactivos que presentan interacción con la fase estacionaria o la columna. Incremento de la especificidad de la fragmentación del ión molecular para la estimación de estructuras. La formación de nuevos cromóforos para la detección UV de analitos en HPLC. Conversión de analitos hidrofílicos en derivados más hidrofóbicos para su aplicación en RP-HPLC.

Aplicación partícular Desarrollo de un método de derivatización simple para la determinación sensitiva de ácidos grasos por cromatografía de líquidos de alta eficiencia con detección de fluorescencia utilizando 9-(2- hidroxietil)-carbazol como agente de derivatización

Antecedentes La Cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC) con detección de fluorescencia permite el análisis a niveles traza. Estos compuestos presentan una débil absorción en el espectro UV-VIS. Es necesaria la derivatización con reactivos fluorescentes

Desventajas de los reactivos derivatizantes comúnmente usados Tipo CumarinaInestables en medio acuoso, proceso complicado, consumo de tiempo. Tipo DiazometanoSon inestables en los solventes de reacción, no se pueden almacenar por mucho tiempo. Tipo QuinoxanilonaPresentan condiciones drásticas de reacción, debido a su complicado proceso analítico. Tipo BenzofurazanoEl proceso de derivatización para ácidos grasos tiene una duración de 6 horas. Tipo BenzohidrazidaNo se han logrado derivatizar y separar los 20 ácidos grasos más importantes.

9-(2-hidroxietil)-carbazol (HEC) Presenta altos rendimientos de esteres cuando reacciona con ácidos carboxílicos en acetonitrilo a 60°C. En presencia de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) como agente de condensación y 4-dimetilaminopiridina (DMAP) como catalizador básico. El proceso de derivatización es simple y no requiere de la remoción posterior de reactivos en exceso y solventes. Contiene un par libre de electrones que incrementa significativamente la detección de los derivados. Este proceso se puede aplicar para la determinación de ácidos grasos.

Metodología Síntesis del carbazol-9-il acido acético Mezclar 20 ml de bromoacetato de etilo y 20 ml de metil sulfoxido Adicionar por goteo a 25 g de carbazol, 20 g de hidroxido de potasio y 100 ml de metil sulfoxido a 95° C por 1 hr. Verter en una mezcla de agua e hidroxido de potasio e hidrolizar por 15 min a 100° C Ajustar el pH entre 2.0 – 3.0 remover el precipitado y lavarlo con 3 veces con 50 ml de agua. Recristalizar con tolueno. Reaccionar el carbazol-9-hidroxietil ácido acético con LiAlH4 mediante reflujo en eter durante 2 hr. Adicionar agua para detener la reacción y extraer la mezcla con eter. Lavar 2 veces con una mezcla de carbonato de sodio al 10% y agua Extraer 3 veces el residuo con heptano calentado SE obtiene un producto blanco que debe ser filtrado y cristalizado nuevamente. Síntesis del 9-(2-hidroxietil)-carbazol

Metodología Derivatización Tomar una muestra de 100  l de una mezcla estándar de ácidos grasos. Adicionar 200  l de DMAP (catalizador básico), EDC (agente de condensación) y reactivo HEC Poner la mezcla a reaccionar en un baño de agua a 60° C por 30 min. Diluir 10  l de la mezcla cruda a 100  l con acetonitrilo Inyectar 10  l de esta solución diluida en el cromatógrafo.

Instrumentación Cromatógrafo de líquidos marca Hitachi modelo 655 Detector de fluorescencia marca Hitachi modelo S Válvula de inyección marca Rheodyne modelo 7125 Válvula de proporción marca Hitachi modelo 655 Integrador marca Hitachi modelo Columna C18 de 200mm × 4.6 mm d.i. (5  m) marca Spherisorb Baño de agua marca Paratherm U2 (para controlar la temperatura de la columna)

Método cromatográfico Las muestras fueron eluidas con : Fase A : 40% acetonitrilo con 0.1% de ácido acético en agua. Fase B : 0.1% de ácido acético en acetonitrilo puro. El gradiente de elución fue de 40% (A) a 100% (B). Velocidad de flujo constante de 1 ml/min. La temperatura se mantuvo a 35° C. Se utilizó ácido butanoico como estándar interno.

Resultados Se determinó que los derivados eran lo suficientemente estables para el análisis por HPLC, al no encontrarse cambios significativos en el área de los picos durante un periodo de 24 hr. Se encontró que la intensidad de la fluorescencia en el estándar interno disminuye con el aumento de la temperatura.

El uso de acetonitrilo y el acetato de etilo como solventes de reacción para el proceso de derivatización proporcionó las respuestas de detección más altas. Se prefirió el uso del acetonitrilo debido a la inmiscibilidad del acetato de etilo en la fase móvil. Resultados

Resultados Se obtuvo una respuesta del detector más alta utilizando como catalizador básico 4-dimetilaminopiridina (DMAP). Se analizaron dos agentes de condensación, resultando más apropiada la 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida clorhídrica (EDC-HCl) obteniéndose un repuesta del detector de 2 a 3 veces mayor que utilizando diciclohexilcarbodiimida (DCC)

Resultados Se analizaron las mejores condiciones de temperatura y tiempo de derivatización resultando ser de 60° C y 30 min, respectivamente.

Resultados El detector operó a las longitudes de onda de excitación y emisión máximas de 335 y 360 nm, respectivamente. Las fases móviles que proporcionaron una mejor separación en el menor tiempo fueron: (A) 40% acetonitrilo con 0.1% de ácido acético en agua (B) 0.1% de ácido acético en acetronitrilo puro. Condiciones de gradiente: Inicial 0-5 min=70% A 20 min= 100% B (manteniendose por 25 min)

Con base en las condiciones óptimas de derivatización se realizó el análisis de linearidad a los ácidos mirístico y esteárico. Las ecuaciones de regresión obtenidas fueron: y = X (n = 6, γ 2 = 0.997) para el ácido mirístico. y = X (n = 6, γ 2 = 0.998) para el ácido esteárico. Por último se evaluó la precisión del método propuesto Resultados

La derivatización de ácidos grasos con HEC ofrece las ventajas de: No requerir un agente de fase, ni solventes con alta toxicidad. La derivatización ocurre rápidamente y de forma sencilla. Los reactivos y los ácidos grasos derivados son estables. Es un método fácil, económico, sensible y reproducible. Se obtiene una separación de 20 ácidos grasos en 38 min bajo las condiciones propuestas. Conclusiones

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