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Electroforesis SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulphate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
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Objetivo general de esta sección
Monitoreo del proceso de purificación de la LDH por separación de las proteínas de las distintas fracciones en un gel de SDS-acrilamida y tinción con azul coomassie.
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Objetivos particulares de esta sección
Calcular cantidad de proteína de fracciones para cargar 25 µg de cada fracción en pozo (se prepara en un exceso de 3 veces) Construcción de tabla Fracción [Prot] µg/µL µL para 75 µg H2O cbp 25 µL F1 (Ejemplo) 54 1.39 23.61 F2 F3 F4 Nota: Buffer de carga (6X) = BC = 5 µL. Vol final= 30 µL 54 µg µL 75 µg X X= 75 µg * 1 µL / 54 µg = 1.39 µL Si F5s están diluidas, tomar 25 µL de fracción y 5 uL BC
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¿Qué hacer en la práctica?
Preparar muestras con 75 µg en 30 µL (5 µL BC 6X) de cada fracción Desnaturalizar muestras: 85°C, 5 mins. Hacer SDS-PAGE. Aplicar 10 µL/ pozo Correr SDS-PAGE: 120 V por 2 hr Sacar gel de cámara y teñir con azul de Coomassie por 1 hr Desteñir con agua O/N
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Electroforesis Método analítico para la separación y análisis de macromoléculas (DNA, RNA, Proteínas) y productos de su fragmentación, basándose en su carga y tamaño.
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APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS SDS-PAGE
Monitoreo de pasos de purificación Western- blots Determinación de masa molecular. · Verificación de la concentración de proteínas. · Detección de proteólisis. · Identificación de proteínas inmunoprecipitadas. · Separación de proteínas marcadas con isótopos radioactivos.
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Tipos de electroforesis
PAGE nativa PAGE nativa de gradiente PAGE de Urea PAGE de SDS PAGE de SDS de gradiente IEF 2D PAGE Western blot Far western
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ELECTROFORESIS SDS-PAGE
SDS : dodecil sulfato de sodio: Detergente aniónico En la electroforesis SDS-PAGE el SDS se agrega en TODO!!!! 1. En el gel 2. En el buffer de muestra 3. En el buffer de corrida
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Electroforesis SDS-PAGE
REACTIVOS UTILIZADOS Para hacer la matriz (el gel) Tetrametiletilendiamino (TEMED) N,Nʼ-metilen-bis-acrilamida Acrilamida Persulfato de amonio
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¿Cómo se forma la matriz (el gel)?
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MATRIZ DE POLIACRILAMIDA
Fase líquida o un gel muy poroso Gel de poliacrilamida
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Acrilamida Químicamente inerte
Estable en un amplio rango de pH, temperatura y fuerza iónica Insoluble en agua La matriz (el gel) se puede preparar de forma rápida y reproducible Se puede variar la concentración de acrilamida y bisacrilamida para modificar de manera controlada el tamaño del poro: MAYOR RESOLUCIÓN
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Rango de separación (tamaño)
En esta técnica es posible modificar los porcentajes de acrilamida para obtener una mayor resolución % de Acrilamida Rango de separación (tamaño) 15% 15 – 45 kDa 12.5% 15 – 60 kDa 10% 18 – 75 kDa 7.5 % 30 – 120 kDa 5 % 60 – 212 kDa
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ELECTROFORESIS SDS-PAGE
GELES CONCENTRADOR Y SEPARADOR Diferente pH Diferente % de Acrilamida GEL CONCENTRADOR Más poroso (2-5% acrilamida) pH Tris-HCl SDS GEL SEPARADOR Menos poroso (7-15% acrilamida) pH 8.8 Tris-HCl SDS BUFFER DE CORRIDA Tris/Glicina/SDS
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Se utilizan dos amortiguadores:
El buffer de corrida y el buffer de muestra El Buffer de corrida contiene 1. SDS 2. Tris-HCl 3. Glicina
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Se utilizan dos amortiguadores:
El buffer de corrida y el buffer de muestra El Buffer de muestra contiene 1. Beta mercaptoetanol 2. Azul de bromofenol 3. Glicerol
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¿Cómo se consigue el efecto concentrador?
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Resolución de proteínas
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Movilidad electroforética
Velocidad de migración: parámetro característico de una molécula cargada. Depende del pK de los grupos cargados y el tamaño de la molécula. Influencias: tipo de buffer, concentración y pH, la temperatura y el campo eléctrico ejercido, así como la naturaleza del material de soporte.
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Marcadores de Peso Molecular preteñidos
¿Cómo vamos a visualizar las proteínas Marcadores de Peso Molecular preteñidos Frente de corrida
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Los geles se pueden teñir con:
Azul de Comassie Plata (nitrato de plata)
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¿Cómo vamos a determinar el tamaño aproximado de las bandas obtenidas?
Con los estándares de peso molecular: obtenemos el RF
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¿Cómo vamos a determinar el tamaño aproximado de las bandas obtenidas?
Distancia total Frente de corrida
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Gel obtenido por SDS-PAGE que muestra el progreso de una purificación exitosa
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¿Qué hacer en la práctica?
Preparar muestras con 75 µg en 30 µL (5 µL BC 4X) de cada fracción Desnaturalizar muestras: 80°C, 5 mins. Hacer SDS-PAG. Aplicar 10 µL/ pozo Correr SDS-PAGE: 120 V por 2 hr Sacar gel de cámara y teñir con azul de Coomassie por 1 hr Desteñir con agua O/N
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Tipos de electroforesis de proteínas
Nativa. No incluye SDS. Permite analizar proteínas con estructura terciaria y cuaternaria. 2D. Doble separación Primera dimensión: Por su punto isoeléctrico Segunda dimensión: por su tamaño. Protein Hall of Shame
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