CONCORDANCIA DE ALTERACIONES GENÉTICAS EN DNA TUMORAL CIRCULANTE (ctDNA) Y DNA DE CÉLULAS TUMORALES CIRCULANTES (ctcDNA) EN CÁNCER DE MAMA METASTÁSICO (CMM) LUMINAL Esther Navarro Manzano, María Piedad Fernández Pérez, Alejandra Ivars Rubio, Ginés Luengo Gil, Pilar de la Morena Barrio, Elena García Martínez, Enrique González Billalabeitia, Ana Fernández Sánchez, Raul Teruel Montoya, Francisco Ayala de la Peña Hospital G. Universitario Morales Meseguer, Murcia. Universidad de Murcia. IMIB-Arrixaca.

Introducción: ctDNA en CMM RH+ Cáncer de mama metastásico (CMM) RH+ HER2- Resistencia hormonal universal a pesar de nuevas opciones de tratamiento Mecanismos de resistencia múltiples Enriquecimiento en alteraciones genéticas relacionadas con resistencia Diferencias con tumor primario: ESR1, RAS, AKT1, RB1 Adquisición inducida por el tratamiento de mutaciones relacionadas con resistencia endocrina (ESR1, RAS, ERBB2) Valor clínico para decisiones sobre tratamiento Correlación con alteraciones en ctDNA Valoración no invasiva y dinámica Concordancia no exacta con tejido Datos en series de CMM RH+ ctDNA AG % (media) Nº AG (media) Concordancia con tejido TP53 PKI3CA ESR1 AKT1 Chung, 2017 78% 2,5 --- 35% 32% 5% Chae, 2017 -- 2,16 10-15% 33% 24% Clarke, Mol Cell Endocrinol 2015; Cohen, SABCS 2016; Adalsteinsson, Nat Commun 2017; Chae, Mol Cancer Ther 2017; Razavi, Cancer Cell 2018; Chung, Ann Oncol 2017; Cejalvo, BCRT 2017; Fribbens, Ann Oncol 2018

Introducción: ctDNA en CMM RH+ CTC vs ctDNA como biopsia líquida en el CMM ctDNA: identificación de dianas de tratamiento y mecanismos de resistencia CTC: valor pronóstico, seguimiento y monitorización, pero datos más limitados sobre su utilidad para identificar dianas de tratamiento y mecanismos de resistencia Análisis de alteraciones genéticas (heterogeneidad, single CTC): PIK3CA, TP53, etc Análisis de expresión relacionados con resistencia endocrina: CTC-ETI (Paoletti, 2015) Datos limitados sobre concordancia y valor relativo de ctcDNA y ctDNA Estudios dirigidos a mutaciones en ESR1 Paolillo, 2017 (single CTC): 2 pacientes, concordantes Beije, 2017 (pool CTC): 42 pacientes, baja concordancia y no aumento ESR1mut Estudios con paneles de secuenciación Shaw, 2017 (single CTC): CTC (CellSearch) > 100. 5 p. (4RH+ HER2-). Solo PIK3CA/ESR1 Alta concordancia: cfDNA refleja CTC Strauss, 2017 (pool CTC): Epcam+ CTC 5 p. Solo TP53 y PIK3CA Alta concordancia (80%): complementariedad Wan, Nat Rev Cancer 2017; Kratz, ASCO Educ Book 2018; Ramos-Medina & Moreno, CTO 2015; Bidard, Lancet Oncol 2014; Bidard, JNCI 2018; Prestin, Mol Oncol 2015; Paoletti, Clin Cancer Res 2015; Mathew, Clin Cancer Res 2015; Paolillo, Clin Cancer Res 2017; Beije, Mol Oncol 2017; Shaw, Clin Cancer Res 2017; Strauss, Oncotarget 2017

Objetivos Material y métodos Determinar el grado de concordancia y el valor clínico de las alteraciones genéticas detectadas en ctDNA y en ctcDNA en el cáncer de mama RH+/HER2- con resistencia endocrina Relacionar los resultados de secuenciación de ctDNA y CTC con el tipo de resistencia endocrina y la situación de respuesta Material y métodos Pacientes con CMM RH+/HER2- con distintos niveles de resistencia endocrina y distintas situaciones de tratamiento Clasificación de resistencia endocrina de acuerdo a la primera recaída o progresión y de la situación de respuesta con criterios RECIST 1.1 En la misma muestra (30 mL, EDTA; 10 mL, Paxgene): Secuenciación de ctDNA Selección de CTC y secuenciación de ctcDNA Análisis estadístico de concordancia ctcDNA/ctDNA global y en casos con ambas muestras: Chi cuadrado/test Fisher, Kappa

Material y métodos (2) Aislamiento de CTC de SP Enriquecimiento inmuno-magnético basado en Epcam+ Validado con spike-in de MCF7 (LOD: 10 células/7.5 mL) Verificación con ADNaTest: Selección IM y Multiplex RT-PCR Epcam/Muc-1/Her2/Actina) Bioanalizador Agilent 2100 No cuantificación CTC Secuenciación de ctDNA y de ctcDNA DNAp: 24 ng/mL (R: 4.7-84 ng/mL) Procedimiento idéntico y simultáneo para cada pareja de muestras Oncomine Breast cfDNA Assay (Thermo-Fisher): 152 SNV Secuenciador Ion Torrent PGM Análisis bioinformático con Torrent Suite 5.8 (genoma referencia hg19), con optimización para límite de detección 0,1%, y anotación con Ion Reporter 5.6

Resultados (1): pacientes, CTC y alteraciones genéticas Edad, mediana (rango) 56 (37-85) ECOG 0-1 2-3 43 (91%) 4 (9%) Tipo de enfermedad Osea/Partes blandas Visceral Visceral + Osea 23 (49%) 10 (21%) 14 (30%) Resistencia endocrina No resistencia Resistencia primaria Resistencia secundaria 8 (17%) 11 (23%) 28 (60%) Fármaco relacionado con Res. iA Tamoxifeno/Fulv 33 (70%) Situación de respuesta Progresión/Pre-tto EE RP/RC 13 (28%) 26 (55%) Línea de tratamiento actual 1º línea HT 2ª línea HT 3ª o posteriores HT QT cualquier línea 18 (39%) 6 (13%) 4 (8%) 19 (40%) CTC ctDNA Profundidad de cobertura 3.180 x 3.265x Límite de detección 0,08% 0,07% cfDNA AG:61,5% ; media:2,3 ctcDNA AG:87,5% ; media:2,0

Resultados (2): alteraciones genéticas detectadas PIK3CA (24% ctDNA) Exón 9: 55%; exón 20: 45% Resistencia endocrina 1aria (3/9) o 2aria (6/9) Mutaciones TP53 (45% ctDNA) 22 mutaciones distintas en cfDNA 9 mutaciones distintas en CTC (75% TP53mut) Mutaciones AKT1 (13% ctDNA) E17K: activación constitucional Resistencia 1aria o 2aria 1/5 asociada a mut PIK3CA Mutaciones ESR1 (16% ctDNA) LBD/AF2: activadoras Resistencia 1aria o 2aria tras 1ªL SOLO en ctDNA, no en CTC Mutaciones SF3B1 (10% ctDNA) K700E: alteraciones splicing 80% asociadas a ESR1 o AKT1 QT previa (¿hematopoyesis clonal?)

Resultados (3): relación con resistencia y respuesta Resistencia endocrina Situación de respuesta p=NS p=NS p=0,04 p=0,17 ESR1mut Asociación con PD (p=0,013)

Resultados (4): concordancia ctDNA/CTC DNA Datos potencialmente relevantes para el tratamiento: 25% pacientes CTC+ 5% del grupo general

Conclusiones En una serie de CMM RH+/HER2- con resistencia al tratamiento hormonal, hay una baja concordancia entre ctDNA y ctcDNA para las alteraciones genéticas detectadas con un panel de secuenciación dirigida El análisis de ctcDNA permite identificar, en un número limitado de pacientes, alteraciones no presentes en ctDNA y potencialmente relevantes para el tratamiento, por lo que podría complementar el estudio de ctDNA, que aporta la mayor parte de la información. Tanto en ctcDNA como en ctDNA hay una tendencia a un mayor número de alteraciones genéticas en pacientes con resistencia endocrina y, de forma significativa para ctDNA, en pacientes en situación de progresión tumoral El perfil de alteraciones genéticas encontradas en esta población incluye fundamentalmente mutaciones de TP53, PKI3CA, ESR1 y AKT1, y es similar en ctDNA y ctcDNA, excepto para ESR1 (ausentes en ctcDNA) y TP53 (más frecuente proporcionalmente en ctcDNA)