Electroforesis SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulphate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis

Objetivo general de esta sección Monitoreo del proceso de purificación de la LDH por separación de las proteínas de las distintas fracciones en un gel de SDS-acrilamida y tinción con azul coomassie.

Objetivos particulares de esta sección Calcular cantidad de proteína de fracciones para cargar 25 µg de cada fracción en pozo (se prepara en un exceso de 3 veces) Construcción de tabla Fracción [Prot] µg/µL µL para 75 µg H2O cbp 25 µL F1 (Ejemplo) 54 1.39 23.61 F2 F3 F4 Nota: Buffer de carga (6X) = BC = 5 µL. Vol final= 30 µL 54 µg - 1 µL 75 µg - X X= 75 µg * 1 µL / 54 µg = 1.39 µL Si F5s están diluidas, tomar 25 µL de fracción y 5 uL BC

¿Qué hacer en la práctica? Preparar muestras con 75 µg en 30 µL (5 µL BC 6X) de cada fracción Desnaturalizar muestras: 85°C, 5 mins. Hacer SDS-PAGE. Aplicar 10 µL/ pozo Correr SDS-PAGE: 120 V por 2 hr Sacar gel de cámara y teñir con azul de Coomassie por 1 hr Desteñir con agua O/N

Electroforesis Método analítico para la separación y análisis de macromoléculas (DNA, RNA, Proteínas) y productos de su fragmentación, basándose en su carga y tamaño.

APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS SDS-PAGE Monitoreo de pasos de purificación Western- blots Determinación de masa molecular. · Verificación de la concentración de proteínas. · Detección de proteólisis. · Identificación de proteínas inmunoprecipitadas. · Separación de proteínas marcadas con isótopos radioactivos.

Tipos de electroforesis PAGE nativa PAGE nativa de gradiente PAGE de Urea PAGE de SDS PAGE de SDS de gradiente IEF 2D PAGE Western blot Far western

ELECTROFORESIS SDS-PAGE SDS : dodecil sulfato de sodio: Detergente aniónico En la electroforesis SDS-PAGE el SDS se agrega en TODO!!!! 1. En el gel 2. En el buffer de muestra 3. En el buffer de corrida

Electroforesis SDS-PAGE REACTIVOS UTILIZADOS Para hacer la matriz (el gel) Tetrametiletilendiamino (TEMED) N,Nʼ-metilen-bis-acrilamida Acrilamida Persulfato de amonio

¿Cómo se forma la matriz (el gel)?

MATRIZ DE POLIACRILAMIDA Fase líquida o un gel muy poroso Gel de poliacrilamida

Acrilamida Químicamente inerte Estable en un amplio rango de pH, temperatura y fuerza iónica Insoluble en agua La matriz (el gel) se puede preparar de forma rápida y reproducible Se puede variar la concentración de acrilamida y bisacrilamida para modificar de manera controlada el tamaño del poro: MAYOR RESOLUCIÓN

Rango de separación (tamaño) En esta técnica es posible modificar los porcentajes de acrilamida para obtener una mayor resolución % de Acrilamida Rango de separación (tamaño) 15% 15 – 45 kDa 12.5% 15 – 60 kDa 10% 18 – 75 kDa 7.5 % 30 – 120 kDa 5 % 60 – 212 kDa

ELECTROFORESIS SDS-PAGE GELES CONCENTRADOR Y SEPARADOR Diferente pH Diferente % de Acrilamida GEL CONCENTRADOR Más poroso (2-5% acrilamida) pH 6.8 Tris-HCl SDS GEL SEPARADOR Menos poroso (7-15% acrilamida) pH 8.8 Tris-HCl SDS BUFFER DE CORRIDA Tris/Glicina/SDS

Se utilizan dos amortiguadores: El buffer de corrida y el buffer de muestra El Buffer de corrida contiene 1. SDS 2. Tris-HCl 3. Glicina

Se utilizan dos amortiguadores: El buffer de corrida y el buffer de muestra El Buffer de muestra contiene 1. Beta mercaptoetanol 2. Azul de bromofenol 3. Glicerol

¿Cómo se consigue el efecto concentrador?

Resolución de proteínas

Movilidad electroforética Velocidad de migración: parámetro característico de una molécula cargada. Depende del pK de los grupos cargados y el tamaño de la molécula. Influencias: tipo de buffer, concentración y pH, la temperatura y el campo eléctrico ejercido, así como la naturaleza del material de soporte.

Marcadores de Peso Molecular preteñidos ¿Cómo vamos a visualizar las proteínas Marcadores de Peso Molecular preteñidos Frente de corrida

Los geles se pueden teñir con: Azul de Comassie Plata (nitrato de plata)

¿Cómo vamos a determinar el tamaño aproximado de las bandas obtenidas? Con los estándares de peso molecular: obtenemos el RF

¿Cómo vamos a determinar el tamaño aproximado de las bandas obtenidas? Distancia total Frente de corrida

Gel obtenido por SDS-PAGE que muestra el progreso de una purificación exitosa

¿Qué hacer en la práctica? Preparar muestras con 75 µg en 30 µL (5 µL BC 4X) de cada fracción Desnaturalizar muestras: 80°C, 5 mins. Hacer SDS-PAG. Aplicar 10 µL/ pozo Correr SDS-PAGE: 120 V por 2 hr Sacar gel de cámara y teñir con azul de Coomassie por 1 hr Desteñir con agua O/N

Tipos de electroforesis de proteínas Nativa. No incluye SDS. Permite analizar proteínas con estructura terciaria y cuaternaria. 2D. Doble separación Primera dimensión: Por su punto isoeléctrico Segunda dimensión: por su tamaño. Protein Hall of Shame https://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/studies/sds-page/sdsgoofs.html