ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS

Presentación del tema: "ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS"— Transcripción de la presentación:

1 ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS
Rocio Inga Peña Dpto. Bioquímica, Biol Mol & Farmacología

2 Modificaciones: Glicosilación, fosforilación, adición de grupos prostéticos, etc…

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5 Extracto crudo (mezcla de proteínas)

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7 Gel de apilamiento (menor concentración)
Gel de separación (la concentración depende de la resolución que se busque )

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9 Marcadores de Peso Molecular

10 DETERMINACION DEL TAMAÑO DE UNA PROTEINA PROBLEMA
Inicio de corrida (donde inicia el gel separador) Frente de corrida (línea donde termina el colorante)

11 DETERMINACION DEL TAMAÑO DE UNA PROTEINA PROBLEMA
(RF) RF = distancia recorrida por la banda distancia total al frente de la corrida

12 REACTIVOS: Acrilamida (C3H5NO) – formación de polímeros
Bisacrilamida (N,N’- methylenebisacrylamide (C7H10N2O2) - cross-linking entre las cadenas de polímeros SDS : saturación con cargas negativas APS y TEMED : catalizadores de la reacción de polimerización DTT o βME : agentes denaturantes Azul de Bromofenol: Permite la visualización de la corrida electroforética. Carga negativa por encima de pH 4.6.

13 Tinción del Gel SDS-PAGE
La tinción con Azul de Coomassie ( Coomassie Brilliant Blue) puede detectar una banda de hasta 50 ng La tinción con plata incrementa la sensibilidad de detección ( 50 veces aprox)

14 ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL
Separación por: Punto isoeléctrico Tamaño

15 Separación por Punto Isoeléctrico

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19 Punto isoelectrico igual pero diferente tamaño
Punto isoelectrico diferente pero del mismo tamaño

20 Análisis de Proteínas Multiméricas
- Se puede determinar el número y tamaño de subunidades mediante la electroforesis bajo condiciones denaturantes Agentes denaturantes frecuentemente usados: Dithiotreitol (DTT) - β-mercaptoetanol (βME)

21 El Dithiothreitol (DTT) es un agente denaturante

22 PRACTICA A REALIZAR ELECTROFORESIS DE PROTEINAS EN UNA DIMENSION
CONDICIONES: DENATURANTES (SDS, BME, alta temperatura)

23 Las muestras para analizar serán diferentes fracciones obtenidas durante la purificación de la Pirazinamidasa: Extracto crudo Fracción con proteìna, sin actividad Fracción con proteìna, con actividad

24 Dos tipos de tratamiento de muestras:
A) Denaturación directa de las muestras: Mezclar 25 uL de la fracción + 15 uL de Loading Buffer (Buffer de carga) Hervir por minutos Cargar uL en el gel. B) Precipitación previa a denaturación - Se utilizará el protocolo de precipitación con Etanol (33%)

25 Actividad enzimática Cantidad de Proteína (Pirazinamidasa) (Bradford)