APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS SDS-PAGE

Presentación del tema: "APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS SDS-PAGE"— Transcripción de la presentación:

1 Electroforesis SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulphate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis

2 APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS SDS-PAGE
· Determinación de masa molecular. · Verificación de la concentración de proteínas. · Detección de proteólisis. · Identificación de proteínas inmunoprecipitadas. · Separación de proteínas marcadas con isótopos radioactivos.

3 ELECTROFORESIS: Método analítico.
En un campo eléctrico las moléculas cargadas migran en la dirección del electrodo que tiene una carga opuesta.

4 Movilidad electroforética
Medición de la velocidad de migración: parámetro característico de una molécula cargada. Depende de la pK de los grupos cargados y el tamaño de la molécula. Influencias: tipo de buffer, concentración y pH, la temperatura y el campo eléctrico ejercido, así como la naturaleza del material de soporte.

5 ELECTROFORESIS SDS-PAGE
SDS : dodecil sulfato de sodio DETERGENTE ANIÓNICO En la electroforesis SDS-PAGE el SDS se agrega en TODO!!!! 1. En el gel 2. En el buffer de muestra 3. En el buffer de corrida

6 Electroforesis SDS-PAGE
REACTIVOS UTILIZADOS Para hacer la matriz (el gel) Tetrametiletilendiamino (TEMED) N,Nʼ-metilen-bis-acrilamida Acrilamida Persulfato de amonio

7 ¿Cómo se forma la matriz (el gel)?

8 MATRIZ DE POLIACRILAMIDA
Fase líquida o un gel muy poroso Gel de poliacrilamida

9 Acrilamida Químicamente inerte
Estable en un amplio rango de pH, temperatura y fuerza iónica Insoluble en agua La matriz (el gel) se puede preparar de forma rápida y reproducible Se puede variar la concentración de acrilamida y bisacrilamida para modificar de manera controlada el tamaño del poro: MAYOR RESOLUCIÓN

10 Rango de separación (tamaño)
En esta técnica es posible modificar los porcentajes de acrilamida para obtener una mayor resolución % de Acrilamida Rango de separación (tamaño) 15% 15 – 45 kDa 12.5% 15 – 60 kDa 10% 18 – 75 kDa 7.5 % 30 – 120 kDa 5 % 60 – 212 kDa

11 ELECTROFORESIS SDS-PAGE
GELES CONCENTRADOR Y SEPARADOR Diferente pH Diferente % de Acrilamida GEL CONCENTRADOR Más poroso (2-5% acrilamida) pH Tris-HCl SDS GEL SEPARADOR Menos poroso (7-15% acrilamida) pH 8.8 Tris-HCl SDS El buffer de corrida Tris/Glicina/SDS

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13 Se utilizan dos amortiguadores:
El buffer de corrida y el buffer de muestra El Buffer de corrida contiene 1. SDS 2. Tris-HCl 3. Glicina

14 Se utilizan dos amortiguadores:
El buffer de corrida y el buffer de muestra El Buffer de muestra contiene 1. Beta mercaptoetanol 2. Azul de bromofenol 3. Glicerol

15 ¿Cómo se consigue el efecto concentrador?

16 Marcadores de Peso Molecular preteñidos
¿Cómo vamos a visualizar las proteínas Marcadores de Peso Molecular preteñidos Frente de corrida

17 Los geles se pueden teñir con:
Azul de Comassie Plata (nitrato de plata)

18 ¿Cómo vamos a determinar el tamaño aproximado de las bandas obtenidas?
Con los estándares de peso molecular: obtenemos el RF

19 ¿Cómo vamos a determinar el tamaño aproximado de las bandas obtenidas?
Distancia total Frente de corrida

20 Elaboramos una gráfica con los datos obtenidos de los estándares de peso molecular

21 Gel obtenido por SDS-PAGE que muestra el progreso de una purificación exitosa

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