Proteína recombinante

Presentación del tema: "Proteína recombinante"— Transcripción de la presentación:

1 Proteína recombinante
β-Lactamasa

2 Tecnología de DNA recombinante: Herramientas

3 Tecnología de DNA recombinante: Herramientas

4 cDNA

5 Inducción a las proteínas recombinantes
Las proteínas recombinantes se obtienen a partir de una especie o una línea celular distinta a la célula original. Ventajas de expresar proteínas recombinantes en bacterias: fácil de cultivar fácil de modificar genéticamente trabajo rápido alto rendimiento (80%) ahorro de $$$$$ Retos de expresar genes de eucariontes en bacteria..... Estructura terciaria y cuaternaria modificaciones post-traduccionales Incompatibilidad de codones .... depende de la complejidad de la proteína

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7 Clonación del DNA DNA foráneo (secuencia que se desea clonar)
Vector de clonación (vehículo) Organismo huésped (E. coli) Ajuste de condiciones Vector híbrido o recombinante

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9 OPERON LAC “Operón”: Es una unidad de transcripción: genes estructurales regulados por un promotor y un operador .

10 El REPRESOR Homo tetramero (154 kDa M, 520 kDa T)

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12 En este tipo de operador inducible, el REPRESOR sólo puede unirse al DNA en ausencia de lactosa, la que funciona como un INDUCTOR.

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15 Vector de clonación pET-24a(+)

16 Selección de bacterias transformadas

17 Un gene siempre tiene que ir flanqueado por una zona promotora y otra de paro de la transcripción

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19 El sistema de expresión también debe tener las siguientes características:
Cromosoma de Escherichia coli

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21 Además el vector PET tiene la secuencia del promotor T7 y de LacO cerca de la secuencia del transgene

22 Análogos de la lactosa

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25 Procedimiento Tomar 2.5 mL de precultivo de E. coli transformado con vector, añadir a 15 mL de LB (17.5 mL) Incubar con agitación a 37 ͦ C hasta OD Tomar T0 (1 mL) e inducir con IPTG 0.5 ó 1 mM (final) Continuar incubando. Tomar alícuotas (1 mL) cada 30 min por 2 h. Después de cada toma centrifugar y guardar sobrenadante (!!!) Tomar 18 µL y mezclar con 12 µL de BC, desnaturalizar (10 min a 95 ͦ C). Correr en SDS-PAGE.

26 Peculiaridades de la construcción:
En vector pET-TEM se insertaron genes que codifican para dos proteínas: 1) β-lactamasa 2) OmpA: Proteína de tránsito que se inserta en la membrana externa de las bacterias. (Pag. 43 del manual) Por lo tanto: no se requiere la extracción de la β-lactamasa, esta será secretada al medio tras su síntesis

27 Purificación de la proteína recombinante

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29 RESULTADOS DEL ALGÚN SEMESTRE EN EL PASADO….
2h h h Después de la inducción

30 Proteina GFP

31 Purificación de la proteína recombinante