Geles de Polyacrilamida Desnaturalizantes y Nativos

Presentación del tema: "Geles de Polyacrilamida Desnaturalizantes y Nativos"— Transcripción de la presentación:

1 Geles de Polyacrilamida Desnaturalizantes y Nativos
Visualización de proteínas purificadas

2 ¿Qué saben de electroforésis en geles de polyacrilamida con SDS?

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4 Sistema de buffer discontinuo:
Disociación de proteínas en subunidades por efecto del calor, SDS (detergente aniónico) y un agente reductor (DTT o β-Mercaptoetanol). La cantidad de SDS unida es proporcional a la masa molecular, por lo cual la relación carga/masa = para todas las moléculas de proteína (la carga ppia es despreciable). Se llama Sistema de Buffer Discontinuo, y crea fronteras móviles creadas por la corriente eléctrica.

5 Tanto la muestra como el stacking tienen Tris-HCl pH 6
Tanto la muestra como el stacking tienen Tris-HCl pH 6.8, mientras que el buffer superior e inferior tienen Tris-Glicina pH 8.3, y el gel separador tiene Tris-HCl pH 8.8. Cuando se aplica electricidad, los Cl- en la muestra y stacking forman el borde lider de la frontera móvil, seguido de la muestra (carga -) y por atrás la glicina, que a ese pH está en la forma zwitterionica (carga neta = 0)

6 Esta frontera móvil se va achicando, y por ende se “stackean” las proteínas; cuando se llega al gel separador, toda la proteína está en una fina línea. Ahí es donde cambia el pH a 8.8 en el gel separador, la glicina ahora tiene carga (-) y ahora migra con el Cl- por delante de las proteínas, que ahora tienen vía libre para separarse por tamaño

7 La concentración de acrilamida:bisacrilamida va a determinar el tamaño del poro, y este tamaño es el que va a crear resistencia al pasaje de las proteínas. Dependiendo del porcentaje de acrilamida:bisacrilamida, la misma muestra va a correr de manera diferente.

8 Nosotros vamos a hacer 2 geles, 1 nativo y otro desnaturalizante.
En el gel nativo, las proteínas se corren por su carga intrínseca (como tiene que ser?), y se van a separar según esta carga y su tamaño, pero lo bueno es que no están desnaturalizadas, entonces podemos ver una banda verde de GFP iluminando el gel con luz UV en el transiluminador. En el gel desnaturalizante, las proteínas van a separarse solo por su tamaño (todas tienen carga negativa) y están desnaturalizadas, por lo cual GFP ya no va a ser fluorescente, pero podemos ver todas las proteínas tiñiendo con Coomassie.

9 Qué es lo que esperamos? Corte Trombina Eluido Glutation GFP
GST + GST-GFP ¿Como se vería esto corriendo en un SDS-PAGE y tiñiendo con Coomassie? ¿Como se vería en un gel nativo y visto al UV? ¿Qué es cada banda? Coomassie Nativo Tromb. Glut. Tromb. Glut.

10 A TRABAJAR!