Monitoreo de un proceso de purificación de proteínas

Presentación del tema: "Monitoreo de un proceso de purificación de proteínas"— Transcripción de la presentación:

1 Monitoreo de un proceso de purificación de proteínas
Corrimiento electroforético de las muestras Determinación de la actividad frente a un ligando específico

2 FUNDAMENTO DE LA ELECTROFORESIS
Estudia la migración de las particulas coloidales en el seno de un campo eléctrico

3 SEPARACIÓN DE LOS ELEMENTOS DE UNA MEZCLA
Separa los diferentes elementos que componen una mezcla compleja en función de la carga eléctrica de los mismos

4 MIGRACIÓN ELECTROFORÉTICA
Es la movilidad de la molécula por unidad de campo eléctrico - + Aplicación

5 VELOCIDAD DE LAS PARTICULAS
Depende de ... La carga de las mismas La intensidad del campo eléctrico y Del coeficiente de fricción de las moléculas con el medio

6 TIPOS DE ELECTROFORESIS
Libre Tipos de electroforesis Papel Sobre soporte Acetato de celulosa Almidón Poliacrilamida Agar Gel

7 ¿Qué es la electroforesis?
Es la técnica que permite la separación de proteínas con diferente peso molecular y/o carga eléctrica. Existe diversidad de sistemas electroforéticos: Tubos, placas de vidrio Geles nativos, desnaturalizantes o reductores En primera o segunda dimensión

8 ¿Cómo se separan las mezclas de proteínas en una electroforesis?
En base a su carga eléctrica En base a su peso molecular. Fundamento. Las proteínas tienen una carga eléctrica neta y un peso molecular determinado por lo que al imponer un campo eléctrico las proteínas migraran.

9 Desnaturalización de las proteínas
Se pueden uniformar las cargas de una proteína, entonces se moverán en el gel en base a su peso molecular

10 Componentes de un gel de acrilamida
Acrilamida es la molécula que es polimerizada para dar largas cadenas las cual al ser entrecruzadas constituyen el gel soporte. N, N, Metilenbis acrilamida. Esta molécula entrecrua químicamente las cadenas lineales de acrilamida, originando la malla consistente y porosa

11 Continúa.. Persulfato de amonio. En soluciones acuosas forma radicales libres, los cuales reaccionan con los monómeros de acrilamida, preservándose en forma de radicales que pueden polimerizarse, es el catalizador. TEMED ((N,N,N,N'-tetrametilnediamina) Existe en forma de radicales libres por lo cual contribuye a la reacción de polimerización acelerándola.

12 Reacción de polimerización de poliacrilamida

13 El polímero que se forma es:

14 Preparación de dos geles
A) el gel separador B) el gel concentrador

15 La proteína se mezcla con amortiguador de muestra y se calienta
Calentar la muestra en presencia de SDS ayuda a romper la estructura secundaria, terciaria y cuaternaria de la proteína. Pero no rompe los puentes disulfuro.

16 SDS para electroforesis desnaturalizante

17 Para romper el puente disulfuro...
Se añaden agentes como -mercaptoetanol o DTT, ambos reducen el puente disulfuro y por tanto la estructurura terciaria o cuaternaria.

18 Como se vería el corrimiento electroforético de una proteína si no usamos DTT
Cuándo una proteína no tiene puentes disulfuro

19 Pero cuando si tiene puentes disulfuro

20 Equipo utilizado

21 Hay que conocer las limitantes para la separación
Mucha proteína no deja que se resuelva, es decir se separen las proteínas una de otra.

22 Además para visualizar a la proteína hay que escoger el método de tinción adecuado.
Tinción con plata de geles de proteínas. facilidad de uso y su gran sensibilidad, entre 50 y 100 veces más sensible que la tinción con Azul de Coomasie Tinción con azul de Coomasie.             

23 Es útil también cargar estándares de peso molecular

24 Migración de estándares de peso molecular en un gel de poliacrilamida

25 Cargado de las muestras

26 Apariencia de proteínas corridas en un gel y teñidas con azul de Coomasie

27 Isoelectroenfoque

28 2D Gel Electrophoresis Simultaneous separation and detection of ~2000 proteins on a 20x25 cm gel Up to 10,000 proteins can be seen using optimized protocols

29 IEF Principles A N O D E + _ C T H Increasing pH pI = 8.6 pI = 6.4