Producción de lisozima funcional humana a partir de vacas clonadas transgénicas Almada Martina Bubas Ignacio Capello Gianluca Caporalini Fiona Lerda Tiago Neri Juan Tsou Marcos Vazquez Martin

“Son animales que han sido modificados genéticamente, añadiendo genes foráneos de manera deliberada, para cambiar alguna característica del animal, sea para añadirle alguna funcionalidad o bloquear la expresión de un gen.”

Lisozima Importante proteína natural que participa en la respuesta inmune de infantes contra infecciones virales y bacterianas. El estudio consistió en generar vacas clonadas transgénicas con el vector pBAC-hLF-hLZ, el cual expresó de manera eficiente la rhLZ en leche vacuna. Lisozima recombinante: peso molecular, actividad enzimática y mismas secuencias de aminoácidos en sus extremos amino y carboxilo terminales que la lisozima humana. Para mejorar el contenido nutricional de las fórmulas infantiles, se llevaron a cabo varios intentos con el fin de agregar a la leche bovina proteínas humanas como α-lactoalbúmina, lactoferrina y lisozima.

Métodos

Construcción del plásmido libre de marcador . El plásmido 706-Cre (capaz de expresar Cre-recombinasa) fue transformada en células competentes que contienen el plásmido pBAC-hLF-hLZ-Neo cargando un marcador de selección “floxed” (flanqueado por sitios LoxP) . Después de preparar el plásmido de ADN fue re-transformado e identificado por análisis de PCR.

Análisis de PCR El par de primers P-HLZ-637F/R amplifica un producto de 637 pares de bases. El par de primers P2F/R se utilizó para identificar el plásmido recombinado pBAC- hLF-hLZ. Tamaño del plásmido no recombinado: 2541 pares de bases. Tamaño del plásmido recombinado: 800 pares de bases.

Cultivo y transferencia nuclear Se aislaron fibroblastos fetales bovinos y se transfirió un fragmento del plásmido pBAC-hLF-hLZ alineado con una endonucleasa de restricción NotI y purificado con el cromosoma artificial bacteriano. Reactivo: Amaxa Nucleofector.

PCR Cuantitativa A través de PCR en tiempo real, utilizando SYBR Green como agente intercalante, se usó para evidenciar el número de copias de transgenes en las vacas transgénicas. Producto amplificado: 112 pares de bases. Controles: gen de la miostatina + curva estándar utilizando ADN WT

Recolección de la leche Inductores de lactancia: medroxiprogesterona acetato y benzoato de estradiol. El porcentaje de grasa, proteínas, lactosa, y materia seca fueron determinados con MilkoScan4000. Se analizó la leche con electroforesis y Western Blot. Electroforesis: gel de poliacrilamida tris-glycine 12%. Las proteínas se cuantificaron tiñendo con azul brillante de Coomassie. Western Blot: gel de poliacrilamida tris-glycine 15%. Las proteínas se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilo incubadas con anticuerpos anti-hLZ y anticuerpo anti-igG de conejo.

Purificación de la rhLZ Centrifugación para separar fase grasa. Se utilizó el método de cromatografía de intercambio iónico.

Purificación por cromatografía de intercambio iónico Permite separar moléculas por sus características de carga.

Cromatografía de intercambio iónico

Cromatografía de intercambio iónico

Cromatografía de intercambio iónico

Cromatografía de intercambio iónico

Resultados

Construcción del plásmido pBAC-hLF-hLZ-libre de indicador. Se realizó utilizando el sistema controlador de expresión génica Cre-lox, provocando la deleción del marcador Neo. pBAC-hLF-hLZ-libre de indicador definitivo tenía una longitud de 125 kb, que contenía un fragmento genómico de ADN de lisozima humana de 4,8 kb, uno de 89 kb 5’UTR y uno de 31 kb 3’UTR. El plásmido fue confirmado por un análisis de PCR, y el tamaño esperado del producto de PCR fue de 800 pb.

Screening de colonias celulares transgénicas positivas y generación de vacas transgénicas clonadas por transferencia nuclear. El plásmido codificante para la rhLZ fue transfectado dentro de las colonias celulares 0901FFB, y 1003FFB de fibroblastos bovinos fetales. Los análisis de PCR confirmaron 17 colonias celulares positivas, de las cuales tres fueron usados como células donantes para la transferencia nuclear (#21, #27, y #14). Se transfirieron 241 blastocistos transgénicos clonados en 161 vacas destinatarias.

Integración del transgen al genoma PCR SOUTHERN BLOT

Integración del transgen al genoma Bandas de intensidad variable → Variación en el número de copias del gen 0810, 0824, 0915 y 0927 dos copias 0906 8 copias 0910 9 copias PCR tiempo real

Expresión de rhLZ en la leche de las vacas clonadas SDS-PAGE Western Blot

Examen funcional → Prueba bactericida (micrococcus lysodeikticus)

Purificación de la rhLZ

Confirmación de la purificación de la rhLZ WESTERN BLOT ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

Conclusión Lisozima humana y rhLZ. Objetivo → producir vacas transgénicas clonadas como animales mamarios bioreactivos con altos niveles de expresión de rhLZ en su leche. Desafíos superados: -lograr altas concentraciones de rhLZ. -eliminar el gen de resistencia antibiótica. -eliminar el gen marcador. -lograr propiedades fisicoquímicas de la rhLZ similares a las de origen natural.

Resultados finales Los resultados de este estudio analizado sientan una base sólida para las aplicaciones futuras y adicionales de rhLZ.

¡Muchas gracias!