BIOTECNOLOGÍA Tecnología del ADN recombinante Producción de insulina

BIOTECNOLOGÍA Tecnología del ADN recombinante Producción de insulina
Organismos transgénicos Clonaciones Genómica y protéomica DRM-Biotecnología SB 2012

Tecnología del ADN recombinante
Herramientas: Células donantes Genes Células receptoras Vectores (plásmidos, cósmidos, cromosomas artificiales, bacteriófagos, vectores de levaduras) Enzimas de restricción Transcriptasa reversa Ligasas Sondas de ADN DRM-Biotecnología SB 2012

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Características de los vectores: los plásmidos

Enzimas de restricción o endonucleasas
Enzimas específicas que reconocen ciertas secuencias blanco en el ADN llamadas palíndromos y lo cortan en fragmentos de variada longitud (fragmentos de restricción). Las enzimas de restricción pueden cortar dejando extremos romos o cohesivos. La variedad y cantidad de los fragmentos obtenidos depende de las enzimas usadas. Esta característica es única y difiere entre los individuos de una misma especie, por lo que sirve como identificación de personas y se la conoce como polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLPs). DRM-Biotecnología SB 2012

Cómo actúan las enzimas de restricción

Cómo se usan las enzimas de restricción para insertar genes en un plásmido

Técnicas frecuentemente usadas: Electroforesis en gel (agarosa o poliacrilamida) PCR Southern blot, Northern blot, western blot Secuenciación de ADN DRM-Biotecnología SB 2012

Electroforesis en gel Separación de moléculas según tamaño y carga aplicando corriente eléctrica. Puede usarse para separar proteínas o para separa fragmentos de ADN. En gel de agarosa En gel de poliacrilamida DRM-Biotecnología SB 2012

Separación de los fragmentos de ADN

TÉCNICAS FRECUENTES PCR Southern blotting PCR
DRM-Biotecnología SB 2012 PCR

Qué se puede hacer: Insertar genes de procariotas a procariotas (bacteria-bacteria) Insertar genes de eucariotas a procariotas (levadura/animal/vegetal – bacteria) Insertar genes de eucariotas a eucariotas (levadura/animal/vegetal -levadura/animal/vegetal) Construcciones de bibliotecas de ADN, genómicas o de cDNA DRM-Biotecnología SB 2012

Aplicaciones de la tecnología del ADN recombinante
Ingeniería genética Estudio de genes específicos responsables de enfermedades Estudio de genes que codifican para enzimas específicas Identificación de personas (medicina forense – antropología - desaparecidos) Producción de proteínas o enzimas específicas para la industria farmacéutica/láctea/vitivinícola, medicina preventiva, etc. Producción de fragmentos cortos de ADN (sondas, primers) DRM-Biotecnología SB 2012

Aplicaciones de la tecnología del ADN recombinante

Ingeniería genética Definición: un conjunto de metodologías que permite transferir genes de un organismo a otro y expresarlos (producir las proteínas para las cuales estos genes codifican) en organismos diferentes al de origen. Algunas aplicaciones En la industria farmacéutica En medicina En agricultura y ganadería En limpieza del medio ambiente DRM-Biotecnología SB 2012

Ingeniería genética en bacterias: Producción de insulina humana a escala industrial

Se aísla el gen de la insulina a insertar
PASOS Se aísla el gen de la insulina a insertar Se aísla el plásmido con genes marcadores de la bacteria y se lo corta con ER Se incuba el plásmido abierto + gen + ligasa Se introduce el plásmido recombinante en las bacterias Se seleccionan las bacterias que hayan adquirido el plásmido recombinante deseado (en 2 pasos, ver diapo. siguiente.) Se cultivan las bacterias en tanques fermentadores, donde se reproducen y sintetizan grandes cantidades de la proteína insulina Se extrae y separa la proteína insulina, se la purifica, se la embotella y finalmente se la comercializa. DRM-Biotecnología SB 2012

Selección de las bacterias
Supongamos que el plásmido contiene los genes marcadores Tet® y Amp® (genes de resistencia a los antibióticos tetraciclina y ampicilina) y se quiere insertar el gen de la insulina en el lugar del gen Amp®. ¿Cómo sabemos qué bacterias cultivar en tanques? Para discriminar entre bacterias que adquirieron o no el plásmido, se cultivan a las bacterias en un medio con el antibiótico tetraciclina. Para diferenciar a aquellas bacterias que poseen el gen de la insulina insertado en el lugar correcto de las que lo tienen en otro lugar del plásmido, se cultivan a las bacterias sobrevivientes del caso anterior en un medio con ampicilina. Para esto se utiliza la técnica de transferencia; luego se marcan las colonias que poseen el plásmido deseado y se las cultiva aparte. DRM-Biotecnología SB 2012

Del laboratorio a la industria

2) Ingeniería genética en plantas: Producción del maíz Bt
Qué se necesita: Agrobacterium tumefaciens (bacteria que será usada como vector natural). Esta bacteria tiene un plásmido con dos regiones importantes: Ti (inductor de tumores) y vir (le confiere la capacidad de infectar e introducirse en células vegetales). Bacillus thurigiensis (aporta el gen de resistencia al ataque de la plaga- el gen “insecticida” natural) Medios de cultivos con hormonas de crecimiento para células vegetales Planta de maíz a modificar Macetas en invernaderos – área de cultivo DRM-Biotecnología SB 2012

Este maíz transgénico se lo conoce en el mercado como maíz Bt.
En el caso particular de la producción de una variedad de maíz que resista el ataque de insectos, el organismo dador es la bacteria del suelo denominada Bacillus thuringiensis (Bt) de la cual se extrae el gen que determina la síntesis de la proteína insecticida, y el organismo receptor del gen es la planta de maíz. El vector usado es la bacteria Agrobacterium tumefaciens quien naturalmente posee la capacidad de infectar plantas causando tumores. En esta técnica, la Agrobacterium conserva la capacidad de infectar pero la información genética necesaria para causar tumores es removida. Después de la transformación, se expone el tejido tratado al agente químico selectivo (antibiótico o herbicida). Sólo las células exitosamente transformadas, sobrevivirán. Se usan luego métodos de cultivo de tejidos para regenerar plantas viables de las pocas células sobrevivientes. Este maíz transgénico se lo conoce en el mercado como maíz Bt. DRM-Biotecnología SB 2012

Esquema resumido DRM-Biotecnología SB 2012

Del laboratorio al campo

Maneras de insertar genes en células vegetales
1. Agrobacterium. Uso de una bacteria como "Ingeniero Genético Natural". La bacteria conteniendo el plásmido recombinante, infecta las células de la planta produciendo la recombinación genética. 2. Acelerador de Partículas (Gene Gun). Un cañón artificial bombardea micropartículas con el plásmido recombinante, sobre la célula. 3. Electroporación. Uso de carga eléctrica para que el ADN atraviese la membrana nuclear. La corriente, fuerza el paso de los plásmido recombinante al interior del núcleo. 4. Polietilenglicol. La exposición de las membranas al PEG, facilita el movimiento de las moléculas de ADN. DRM-Biotecnología SB 2012

3) Ingeniería genética en animales: algunos ejemplos

Técnicas en animales DRM-Biotecnología SB 2012

Obtención de animales transgénicos: pharming
Se utilizan animales de granja modificados tal que puedan dar leche que contenga alguna molécula de interés farmacéutico: hormonas, factores de crecimiento, de coagulación, etc. Luego se extrae la molécula de la leche para ser comercializada o se comercializa la leche directamente. Reemplaza a nivel industrial a las bacterias modificadas cultivadas en fermentadores. Se utiliza la técnica de implantación de embriones genéticamente modificados. Estos clones producirán la leche especial. DRM-Biotecnología SB 2012

Un clon es una copia genética idéntica de otro individuo, sea unicelular o multicelular.
La clonación puede ser: Natural: fisión binaria en bacterias y protistas, propagación vegetal, generación de gemelos idénticos. Artificial: producida en laboratorios por medio de manipulación de células y/o embriones. La clonación artificial puede definirse como el proceso por el que se consiguen de modo asexual individuos idénticos a un organismo adulto. Dentro de la clonación artificial, existen 2 tipos: A) Clonación terapéutica B) Clonación reproductiva Clonación DRM-Biotecnología SB 2012

Clonación de Dolly DRM-Biotecnología SB 2012

Para qué sirve la clonación terapéutica
generar células madre uso en la terapia génica (reemplazo de genes defectuosos por normales) reconstrucción de tejidos para implantes DRM-Biotecnología SB 2012

Nuevas aplicaciones de la clonación

Comparación entre desarrollo normal y los diferentes tipos de clonación

Diferencia entre selección artificial y la ingeniería genética

Células madre (stem cells)
Se obtienen a partir de estadíos tempranos del desarrollo embrionario Sirven para lograr varias líneas celulares DRM-Biotecnología SB 2012

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