Bioinformática 2013 - Clase 2 Herramientas informáticas para el clonado, expresión y purificación de proteínas recombinantes Lic. Alexandra Targovnik,

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1 Bioinformática 2013 - Clase 2 Herramientas informáticas para el clonado, expresión y purificación de proteínas recombinantes Lic. Alexandra Targovnik, Bioq. Mariana Bitrian y Dra. Mariela L. Tomazic

2 Herramientas informáticas para el clonado, expresión y purificación de proteínas recombinantes Proteína interés ADN (sec. codificante) Clonado Expresión (elección del huésped) Purificación de la proteína recombinante Procedimiento:

3 Proteína interés ADN (sec. codificante) Clonado Expresión (elección del huésped) Purificación de la proteína recombinante ¿ origen, función y complejidad ? http://www.ebi.a c.uk/ http://www.ncbi.n lm.nih.gov/ β-galactosidasa de Aspergillus niger Procedimiento: Acceso a la información:

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6 Proteína interés ADN (sec. codificante) Clonado Expresión (elección del huésped) Purificación de la proteína recombinante Hartley 1992. ¿ Se conoce la secuencia, se sintetiza o se amplifica el ADNc ? Procedimiento: Acceso a las secuencias:

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10 Proteína interés ADN (sec. codificante) Clonado Expresión (elección del huésped) Purificación de la proteína recombinante Hartley 1992. UniProt ¿ Se conoce la secuencia, se sintetiza o se amplifica el ADNc ? Procedimiento: Acceso a las secuencias:

11 http://www.uniprot.org/uniprot/P29853www.uniprot.org/uniprot/P29853

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15 Clonado: pasos generales 1. Obtención de ADN y digestión con ER: - Amplificación por PCR - Síntesis 2. Obtención de ADN plasmídico y digestión enzimática 3. Ligación: ADN ligasa 4. Transformación y selección de clones 5.Amplificación (fermentación)

16 ¿ En qué vector vamos a clonar ? ¡Importante! - Si uso una sola ER el clonado NO es direccional - Si se quiere direccionar el inserto, se deben usar DOS ER diferentes: buffer debe ser COMPATIBLE para ambas ER ¿Qué enzimas de restricción usaremos? NEB Cutter: http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.phphttp://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php Webcutter: http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/

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18 http://tools.neb.com/NEBcutter2/listbycuts.php?name =3f16d6b3-gi14682embA00968&numcuts=0

19 http://www.promega.com/a/apps/reTool/index.html

20 ¿ En qué vector vamos a clonar ? ¿ Qué más tendríamos que agregar a nuestro gen ? ¿ Cómo y dónde lo agregamos ? ¿ Afectan estas modificaciones a nuestro producto final ? ¿ Código genético, uso de codones ? The genetic code Codon usage Supongamos que vamos a clonar en pRSET

21 ORFs 5´ATCATGAAGCTT3´ Marco +1 5´ATCATGAAGCTT3´ Marco +2 5´ATCATGAAGCTT3´ Marco +3 3´TAGTACTTCGAA 5´ Marco -1 3´TAGTACTTCGAA 5´ Marco -2 3´TAGTACTTCGAA 5´ Marco -3 Complementaria: ORF finder

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23 Diseño de primers Temperatura de fusión (Tm) Tm Forward = Tm Reverse Tm = 55-62ºC T hibridación ~ 5-8ºC menos que la Tm Tamaño del primer12-30 b, óptimo 18 a 24 b Contenido en G+C>= secuencia diana; ideal del 45% al 55% “cepo GC” en 3’termina en T; G o C en dos (máx) de cinco últimas bases Cálculo Tm(A+T)x2 + (G+C)x4 Criterios “positivos”

24 Evitar apareamientos incorrectos Evitar interacción primer-primer (Tm) Evitar poli A/T, poli G/C Evitar estructuras en horquilla Diseño de primers OligoAnalyzer Criterios “negativos” PF (KpnI): AGGGTACCATGAAGCTTTCCTCCGCTTG PR (PSTI): AGCTGCAGCTAGTATGCACCCTTCCGCT Primer3plus

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26 Proteína interés ADN (sec. codificante) Clonado Expresión (elección del huésped) Purificación de la proteína recombinante http://www.expasy.org/tools/ Procedimiento:

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28 Herramientas para el análisis de proteínas http://www.expasy.org/tools/ ProtParam : Parámetro físico-químicos (composición atómica, pI, coeficiente de extinción, Hidrofobicidad). Peptide Cutter: Sitios potenciales de corte por proteasas. Compute: Mw y pI. Protscale: Hidrofobicidad, parámetros conformacionales. InterPro: base de datos integrada de familias de proteínas para predecir dominios y función Reverse Traslate: Proteína- DNA. Signal P: predice péptido señal amino terminal Predicción de estructuras secundarias, terciarias, cuaternarias. Y mas…