Electroforesis en gel. Identificación de clones portadores de un gen de interés -Rastrear todas las colonias con plásmidos recombinantes (Ej. Colonias.

Presentación del tema: "Electroforesis en gel. Identificación de clones portadores de un gen de interés -Rastrear todas las colonias con plásmidos recombinantes (Ej. Colonias."— Transcripción de la presentación:

1 Electroforesis en gel

2 Identificación de clones portadores de un gen de interés -Rastrear todas las colonias con plásmidos recombinantes (Ej. Colonias blancas) -Buscar el gen específico o producto proteico.

3 Rastrear colonias con plásmido recombinante

4 Detectar DNA del gen de interés Desnaturalización del DNA con productos químicos o calor. Hibridación del DNA (conociendo al menos una parte de la secuencia) con sonda de ácido nucleico complementaria marcada con un isótopo radiactivo o marca fluorescente

5 Sondas Hebras simples de DNA o RNA de 5 a mas de 1000 nucleótidos, complementarias a secuencias específicas en el genoma. Para su diseño se requiere conocer la secuencia nucleotídica a la cual debe unirse. Se marca radiactivamente o fluorescentemente. Se puede obtener sintéticamente. Seleccionar bacterias o células luego de un experimento de clonación.

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7 ¿Cómo estudiar la expresión genética con electroforesis en gel? La electroforesis en gel es un método muy usado para separar moléculas de diversos tamaños y es la base de las técnicas que describiremos para identificar ADN, ARN y proteínas.

8 Fundamento de la técnica La técnica se basa en separar a las moléculas en base a su carga, su tamaño, el punto isoeléctrico y otras propiedades físicas. Como los ácidos nucleicos, por ejemplo, poseen un grupo fosfato con carga negativa, frente a un campo energético se moverán hacia el extremo con carga positiva. A medida que se mueven por el gel, la mayor parte de las fibras poliméricas obstruye el paso de las moléculas más largas en mayor medida que el de las moléculas más cortas y de esta manera las separa de a cuerdo con su longitud. Por tanto, la electroforesis en gel separa una mezcla de molécula de ADN lineal en bandas, cada una formada por moléculas de ADN de la misma longitud.

9 Electroforesis en gel Se utiliza generalmente con propósitos analíticos, pero puede ser una técnica preparativa para purificar moléculas parcialmente antes de aplicar espectrometría de masas, PCR, clonación o secuenciación de ADN.

10 Electroforesis en gel Las moléculas son forzadas a través del gel ubicado en un espacio entre dos límites (extremo-electrodo),motivado por una corriente eléctrica.

11 Electroforesis en gel Al situar las moléculas en el gel y aplicar una diferencia de potencial eléctrico, las moléculas se mueven a diferentes velocidades, hacia el cátodo, si están cargadas positivamente, y hacia el ánodo, si están cargadas negativamente.

12 Electroforesis en gel Una aplicación muy importante para la electroforesis en gel es en la tecnología del ADN. Es una de las más importantes herramientas en biología molecular y es de valor crítico en muchos aspectos de la manipulación y estudio genético. Un uso es la identificación de moléculas ADN particulares por los patrones de banda que ellos producen después se der cortado con varias enzimas de restricción.

13 Electroforesis en gel ADN viral, plasmídico y segmentos particulares de ADN cromosomal puede ser identificados por esta técnica. Separación y purificación de fragmentos individuales conteniendo genes interesantes, los cuales pueden ser recuperados del gel con actividad biológica completa.

14 Electroforesis en gel La electroforesis en gel hace posible determinar la diferencia genética y la relación evolutiva entre especies y plantas y animales. Usando esta tecnología es posible separar e identificar las proteínas que difieren en por lo menos en un solo aminoácido.

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25 Resultado de la corrida

26 Resúmen https://www.youtube.com/watch?v=U1g2qt3juZw