Proteína recombinante

Presentación del tema: "Proteína recombinante"— Transcripción de la presentación:

1 Proteína recombinante
β-Lactamasa

2 Tecnología de DNA recombinante: Herramientas

3 Tecnología de DNA recombinante: Herramientas

4 cDNA

5 Inducción a las proteínas recombinantes
Las proteínas recombinantes se obtienen a partir de una especie o una línea celular distinta a la célula original. Ventajas de expresar proteínas recombinantes en bacterias: fácil de cultivar fácil de modificar genéticamente trabajo rápido alto rendimiento (80%) ahorro de $$$$$ Retos de expresar genes de eucariontes en bacteria..... Estructura terciaria y cuaternaria modificaciones post-traduccionales Incompatibilidad de codones .... depende de la complejidad de la proteína

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7 Clonación del DNA DNA foráneo (secuencia que se desea clonar)
Vector de clonación (vehículo) Organismo huésped (E. coli) Ajuste de condiciones Vector híbrido o recombinante

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9 OPERON LAC

10 Vector de clonación pET-24a(+)

11 Selección de bacterias transformadas

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13 Un gene siempre tiene que ir flanqueado por una zona promotora y otra de paro de la transcripción

14 El sistema de expresión también debe tener las siguientes características en su genoma:
Cromosoma de Escherichia coli

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16 El vector PET tiene la secuencia del promotor T7 y de LacO cerca de la secuencia del transgene

17 Análogos de la lactosa

18 Diferencias entre DH5alfa y BL21(DE3)
DH5 alfa: tiene al gen recA mutado, no puede realizar recombinación heteróloga (asegura la estabilidad del inserto). Carece de algunas endonucleasas, impidiendo la digestión del plásmido. Esta cepa es competente para la selección de colonias azules y blancas. BL21. Deficiente en algunas proteasas, degrada menos a las proteínas recombinantes. Emplea a la RNA polimerasa T7 (cepa DE3) que se induce con IPTG.

19 Problemas…

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21 BL21

22 Inducción

23 Procedimiento Tomar 2.5 mL de precultivo de E. coli transformado con vector, añadir a 15 mL de LB (17.5 mL) Incubar con agitación a 37 ͦ C hasta OD Tomar T0 (1 mL) e inducir con IPTG 0.5 ó 1 mM (final) Continuar incubando. Tomar alícuotas (1 mL) cada 30 min por 2 h. Después de cada toma centrifugar y guardar sobrenadante (!!!) Tomar 18 µL y mezclar con 12 µL de BC, desnaturalizar (5 min a 95 ͦ C). Correr en SDS-PAGE.

24 Peculiaridades de la construcción:
En vector pET-TEM se insertaron genes que codifican para dos proteínas: 1) β-lactamasa 2) OmpA: Proteína de tránsito que se inserta en la membrana externa de las bacterias. (Pag. 43 del manual) Por lo tanto: no se requiere la extracción de la β-lactamasa, esta será secretada al medio tras su síntesis

25 Purificación de la proteína recombinante

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27 RESULTADOS DEL ALGÚN SEMESTRE EN EL PASADO….
2h h h Después de la inducción

28 Proteina GFP

29 Purificación de la proteína recombinante