Resistencia a antibióticos en Escherichia coli de origen bovino en Uruguay Ana Umpiérrez1, Inés Bado2, Martín Oliver1, Sofía Acquistapace1, Rafael Vignoli2, Pablo Zunino1 1Departamento de Microbiología, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable Avenida Italia 3318, PC: 11600, Montevideo, Uruguay. 2Departamento de Bacteriología y Virología, Instituto de Higiene, Facultad de Medicina, Universidad de la República Alfredo Navarro 3051, PC: 11600, Montevideo, Uruguay.

Antibiótico Molécula natural, sintética o semisintética capaz de inducir la muerte o detener el crecimiento de una población bacteriana.

Clasificación de los antibióticos -Según su estructura química: Aminoglucósidos β-lactámicos Quinolonas Glicopéptidos

-Clasificación según su mecanismo de acción:

Luego de la introducción de un nuevo antibiótico tarde o temprano se desarrolla resistencia al mismo

MECANISMOS DE RESISTENCIA Resistencia a Antibióticos Mecanismo molecular utilizado por la célula bacteriana para resistir la acción de los antimicrobianos. MECANISMOS DE RESISTENCIA HIDRÓLISIS O INACTIVACION ENZIMÁTICA TRASTORNOS DE PERMEABILIDAD Alteración de influjo Eflujo ALTERACIONES DEL SITIO DE ACCION

Año 2014: Informe multi disciplinario al Primer Ministro David Cameron “La magnitud del problema se acepta ahora. Estimamos que para el 2050, 10 millones de vidas al año y un total de 100 trillones de US$ estarán en riesgo debido al aumento de las infecciones resistentes a los fármacos si no encontramos soluciones proactivas ahora, para frenar el aumento de la resistencia a los medicamentos.”

Resistencia a antibióticos en Escherichia coli de origen bovino en Uruguay Ana Umpiérrez1, Inés Bado2, Martín Oliver1, Sofía Acquistapace1, Rafael Vignoli2, Pablo Zunino1 1Departamento de Microbiología, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable Avenida Italia 3318, PC: 11600, Montevideo, Uruguay. 2Departamento de Bacteriología y Virología, Instituto de Higiene, Facultad de Medicina, Universidad de la República Alfredo Navarro 3051, PC: 11600, Montevideo, Uruguay.

Extraintestinales (ExPEC) Escherichia coli Diarreogénicas (DEC) Extraintestinales (ExPEC) Enterotoxigénica ETEC Enteropatogénica EPEC Enterohemorrágica EHEC Productor de Toxina Shiga STEC Necrotoxigénica NTEC Adherencia difusa DAEC (Kaper et al. 2004; Mainil 2013) Uropatogénica UPEC Meningitis NMEC Forma parte de la microbiota intestinal Patotipos altamente virulentos Importante en los primeros 5 días de vida del ternero (ETEC) (Nguyen et al., 2011)

Antibioticoterapia Uso animal Uso humanos Fluoroquinolonas ¿Colistina? β-lactámicos Fluoroquinolonas Aminoglucósidos Sulfonamidas Otros Uso humanos β-lactámicos Fluoroquinolonas Aminoglucósidos Sulfonamidas (cotrimoxazol) Otros ¿Colistina? Beta-lactámicos en animales: penicilina en humanos: toda la flia los beta-lactámicos se usa Fluoroquinolonas en animales: enrofloxacina en humanos: ciprofloxacina, enrofloxacina, acido nalidixico Aminoglucósidos en animales: estreptomicina en humanos: estreptomicina NO, se usa amikacina, gentamicina y tobramicina. Pero los mecanismos de resistencia pueden afectar varios aminoglucósidos Sulfonamidas: en animales sulfatos en humanos: ppalmente asociado a trimethoprim Cloranfenicol, en humanos no se usa, y si se usa, es muyyyy raro QepA : Altamente descrito en animales MAL USO  Metafilaxis  Promotores de crecimiento ↑ de resistencias

Resistencia en Bacilos Gram negativos Antibioticoterapia β-lactámicos Penicilinas Cefalosporinas 1 a 5ta Generación Carbapenemes Combinaciones con inhibidores de β-lactamasas Resistencia en Bacilos Gram negativos Producción de β-lactamasas (transferibles) Alteración de permeabilidad Alteración del sitio blanco (PBP Proteínas de unión a penicilina) Beta-lactámicos en animales: penicilina en humanos: toda la flia los beta-lactámicos se usa Fluoroquinolonas en animales: enrofloxacina en humanos: ciprofloxacina, enrofloxacina, acido nalidixico Aminoglucósidos en animales: estreptomicina en humanos: estreptomicina NO, se usa amikacina, gentamicina y tobramicina. Pero los mecanismos de resistencia pueden afectar varios aminoglucósidos Sulfonamidas: en animales sulfatos en humanos: ppalmente asociado a trimethoprim Cloranfenicol, en humanos no se usa, y si se usa, es muyyyy raro QepA : Altamente descrito en animales

Resistencia en Bacilos Gram negativos Antibioticoterapia Quinolonas Ciprofloxacina Norfloxacina Enrofloxacina Resistencia en Bacilos Gram negativos Alteraciones del sitio blanco (Girasas) Alteración de permeabilidad/bombas de eflujo Inactivación enzimática/enmascaramiento de sitio blanco/bombas de eflujo (transferibles)

Resistencia en Bacilos Gram negativos Antibioticoterapia Polimixinas Colistina Antibiótico utilizado en humanos como último recurso en infecciones por BGN MRD Resistencia en Bacilos Gram negativos Alteraciones del sitio blanco (LPS)

Resistencias transferibles y elementos genéticos móviles A-Resistencia transferible a Fluoroquinolonas (CIP, NAL, ENRO): Qnr (A, B, S, C, D, E, VC)  enmascaramiento sitio blanco Aac(6´)Ib-cr  inactivación enzimática OqxAB, QepA  bombas de eflujo B-Resistencia transferible a β-lactámicos : β-lactamasas de espectro extendido (BLEE)  inactivación enzimática PLÁSMIDOS ↘ C-Resistencia transferible a Polimixinas: COLISTINA cirpofloxacina En este sentido…plan one health

En Uruguay en las XLIV jornadas uruguayas de Buiatría

Antecedentes en Uruguay Entre el período 76-88 y el 89-00 todas las resistencias bajaron menos…

Antecedentes en Uruguay

105/579 aislamientos resistentes a quinolonas (18%)

OBJETIVO Evaluar los mecanismos de resistencia a antibióticos en E. coli aisladas de heces de terneros con DNT y terneros sanos y su papel como diseminadores de genes de resistencia.

ESTRATEGIA (2012-2014) 1 114 terneros (carne y leche) 1 + 3 5 (N) 2 1 + 1 Sólo enfermos Enfermos/sanos Sólo sanos Necropsia (6 meses) 114 terneros (carne y leche) De 3 a 5 aislamientos de E. coli/p ternero Sanos y con DNT Extensivo e Intensivo Menores de 35 días 2 períodos 2012-14/2016

Estrategia experimental Tamizaje primario (CIP [0,125 μg/ml]) ECOFF para CIP (EUCAST) Antibiogramas (16 ATBs /Kirby-Bauer) CLSI, 2016 Genes de resistencia transferibles a quinolonas (RTQ) y BLEE RTQ: qnr, aac(6´) Ib-cr, qepA (PCR) BLEE: blaCTX-M, blaSHV, blaPER, blaTEM (PCR) ECOFF para ciprofloxacina en E. coli EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing). Tipificación de aislamientos ERIC-PCR MLST Genes de resistencia a Colistina mcr-1 (PCR)

RESULTADOS 477 aislamientos de E. coli 146 aislamientos resistentes a ciprofloxacina (30.6%) 82/83 (98,8%) a ENR, 66 (79,5%) a AMP, 57 (68,7%) a SXT, 20 (24%) a AZM, 16 (19%) a CN y 9 (10,8%) a oxiiminocefalosporinas (6 a CXM y 3 a CRO y/o CAZ), 3 (0,3%) a FOS y uno a AK. 114 terneros 46 animales con resistencia (40.4%)

Mecanismos de resistencia transferibles RTQ 17 aislamientos qnrB2-like 1 aislamiento qnrS1 BLEE 3 aislamientos CTX-M-14 11 animales presentaron alguna RTQ 2 animales presentaron Resistencia a C3G por BLEE dfrA7  R a trimethoprim dfrA17-aadA5  R a trimethoprim-streptomycin and spectinomycin resistance (AMG) dfrA1-aadA1  dfrA12-orfF-aadA2  _SE destaca además el hecho que se ence Ningún aislamientos presentó el gen mcr-1 de resistencia a Colistina

Antibiotic resistance profile Análisis de sensibilidad del primer período de estudio Profile Antibiotic resistance profile Nº of Isolates ESBL PMQR 1 AMP, FQ, SXT 36 - 2 AMP, FQ, CN, SXT 14 qnrB2-like (1) 3 AMP, FQ 13 4 FQ 12 qnrS1-like (1) 5 FQ, SXT qnrB2-like (2) 6 AMP, CXM, FQ, SXT 7 AMP, AMC, CXM, CTX, CAZ, 8 AMP, AMC, CXM, CTX, CAZ, FEP, FQ blaCTX-M-14 (3) 9 AMP, FQ, CN, 10 AMP, FQ, SXT, FOS 11 AMP, FQ, CN, SXT, FOS AMP, CXM, FQ, SX, FOS AMP, CXM, FQ, CN, SXT AMP, CIP* 15 AMP, CIP*, CN, SXT 16 AMP, CIP*, SXT 17 FQ, CN, SXT qnrB2 like (1) 18 Nal, CIP* Total 99 AMP: Ampicillin, FQ: fluoroquinolones, SXT: trimethoprim- sulfamethoxazole, CN: gentamicin, CXM: cefuroxime, CTX: cefotaxime, CAZ: ceftazidime, FEP: cefepime, AMC: amoxicillin- clavulanic acid, FOS: fosfomycin, CIP*: Low level ciprofloxacin resistance, Nal: Nalidixic acid. Brackets: number of isolates showing and ESBL or PMQR profile.

Determinación de clonalidad de los aislamientos resistentes ITU Diarrea Inf. Hospitalarias

DISCUSIÓN La resistencia a antibióticos es un problema en la producción pecuaria en Uruguay. Los aislamientos de E. coli de origen bovino presentan multirressiencia a antibióticos y mecanismos de resistencias transferibles (genes qnr y BLEE). Los perfiles de resistencia determinados y los mecanismos de resistencia detectados podrían jugar un rol importante en enfermedades zoonóticas causadas por E. coli, favoreciendo la dispersión de cepas multirresistentes hacia los seres humanos. It is expected that identification and characterization of native E. coli strains will contribute to the formulation of new effective vaccines. Poner las referencias!!!!...y del nuevo paper.

Plan de acción: programa One health Organización Mundial para la Salud (OMS) Organización Mundial de la Sanidad Animal (OIE) Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO) Creación marcos legislativos: control de uso y comercialización de ATBs Colecta global de información  VIGILANCIA Formación, educación en el uso de ATBs Es en este CONTEXTO…EXISTE UNA GRAN PREOCUPACIÓN A NIVEL MUNDIAL RESPECTOAL USO DE atbs El mencionado plan aboga por la concientización a nivel de todos los países respecto a la necesidad de crear marcos legislativos que puedan controlar el uso y comercialización de los antibióticos, así como en la realización de una colecta global de información, con el fin de generar programas de vigilancia que puedan dar seguimiento de las resistencias (Orand et al. 2016). Asimismo, este informe resalta la importancia de la formación de especialistas y de campañas de educación entre los veterinarios respecto 84ª Asamblea Mundial OIE / Orand et al. 2016

¡GRACIAS! Departamento de Microbiología, IIBCE Martín Oliver Sofía Acquistapace Déborah Ernst Verónica Spinack Ana Umpiérrez aumpierrez@iibce.edu.uy Pablo Zunino pmzunino@gmail.com Laboratorio de Resistencia a Antibióticos Soledad Sienra Inés Bado ibado@higiene.edu.uy Rafael Vignoli rvignoli@higiene.edu.uy ¡GRACIAS!

SÍNTESIS Caracterización molecular de genes de resistencia a antibióticos en E. coli de origen animal. Una elevada cantidad de cepas fue resistente a FQ incluyendo a ENR Ocurrencia de aislamientos multirresistentes Presencia de aislamientos BLEE CTX-M-14 Detección de genes que codifican mecanismos de resistencias transferibles a quinolonas QnrB2-like y QnrS1 Ausencia del gen que codifica a Colistin en aislamientos de E. coli en bovinos Se identificaron 17 ST de E. coli diferentes circulando en Uruguay Complejos ST69 y ST29, distribuidos mundialmente en bovinos y humanos Potencial rol zoonótico de los aislamientos It is expected that identification and characterization of native E. coli strains will contribute to the formulation of new effective vaccines. Poner las referencias!!!!...y del nuevo paper.

Venezuela NDM-1 Ecuador CTX-M-55 E. coli humana (Baron et al. 2016)

Transferencia horizontal Antecedentes Alimentos sin procesar (CIP, FQ) (Chantziaras et al. 2014) Alimentos contaminados (Van Den Bogaard et al. 2002) Contacto animal-hombre (Aubry-Damon et al. 2004; Katsunuma et al. 2007) Elementos genéticos móviles (Integrones) β-lactamasas de espectro extendido (BLEE) Resistencia a Quinolonas Mediada Plásmidos (PMQR) Transferencia horizontal de genes Los principales antibióticos utilizados actualmente a nivel veterinario incluyen miembros de la familia de β-lactámicos, aminoglucósidos, fluoroquinolonas, tetraciclinas y cloranfenicol. Los primeros 3 grupos son también ampliamente utilizados para tratar distintos procesos infecciosos en el ser humano, por lo que la presión de selección ejercida por su utilización a nivel veterinario podría tener un impacto directo en la salud humana, ya sea por la ocurrencia de restos antibióticos en alimentos sin procesar o semi-procesados, por la transmisión de bacterias resistentes entre diferentes huéspedes, o incluso por la movilización de elementos genéticos de resistencia entre microorganismos. (Tenover 2006)

ST de E. coli circulantes en Uruguay Epidemiología molecular ST de E. coli circulantes en Uruguay Humanos ST21;ST56 ST101; ST162; ST336; ST362; ST453; ST1086 ST1087; ST1140; ST4467; ST2449 ST5846; ST5849; ST5851; ST5852 Bovinos Imagen tomada: http://www.oie.int/es ST131; ST405; ST38; ST393; ST603; ST1158 ST3555; ST3626; ST3627 ST69 ST10 Estudios recientes de epidemiología molecular realizados en Uruguay, han permitido detectar la presencia de ciertos ST en bovinos y en los seres humanas. Como son los casos del ST69 (fuertemente asociado a ExPEC Bado el tal??? Umpiérrez ,2016; Oliver, 2017 Papel zoonótico de E. coli de origen bovino