Bqca. QM Alicia I. Cuesta, Consultora Internacional de la FAO Validación de los métodos microbiológicos PROTOCOLO DE VALIDACIÓN Norma ISO 17025 Bqca. QM Alicia I. Cuesta, Consultora Internacional de la FAO

Objetivos a desarrollar Validación de métodos: Intentamos contestar las siguientes preguntas: ¿Qué es validar? ¿Por qué valido? ¿Para qué valido? ¿Cuándo valido? ¿Cómo valido?

¿ Qué es en la práctica validar un método? Es realizar un conjunto de pruebas de manera de: Comprobar varios aspectos del comportamiento del método. Establecer que sirve para el fin previsto. Todo esto debe ser documentado y archivado.

El laboratorio acuerda con el cliente el método a usar para realizar un ensayo. El laboratorio debe usar los métodos y procedimientos más apropiados dentro de su alcance para todos los ensayos. Selección de métodos

Características que se tienen en cuenta para seleccionar el método de ensayo: Propiedades analíticas: precisión, exactitud, especificidad, sensibilidad, el límite de cuantificación y/o de detección, los efectos matriciales Facilidad de uso o automatización. Rapidez de análisis o respuesta. Costo. Método normalizado

Definición de método alternativo: Es un método de análisis que demuestra o estima un analito (un microorganismo, sus componentes o su producto), para una categoría dada de productos, como lo hace su correspondiente método de referencia. El método alternativo exhibe atributos apropiados a las necesidades de los usuarios, por ejemplo: - la velocidad de análisis y/o respuesta; - la facilidad de ejecución y/o automatización; - las propiedades analíticas (la precisión, exactitud, el límite de detección, etc.); - la miniaturización; - el reducción de costo.

¿Qué métodos se validan? LOS MÉTODOS NO NORMALIZADOS. LOS MÉTODOS QUE DISEÑA O DESARROLLA EL LABORATORIO. LOS MÉTODOS NORMALIZADOS EMPLEADOS FUERA DEL ALCANCE PREVISTO. Verifico USO MÉTODOS OFICIALES, MÉTODOS NORMALIZADOS O MÉTODOS DE ORGANISMOS NACIONALES O INTERNACIONALES RECONOCIDOS.

SIEMPRE Y CUANDO ÉSTOS ESTÉN DISPONIBLES ES RECOMENDABLE LA UTILIZACIÓN DE MÉTODOS NORMALIZADOS O DE REFERENCIA, SIEMPRE Y CUANDO ÉSTOS ESTÉN DISPONIBLES Y SEAN APROPIADOS.

SI LA EXPERIENCIA ES ESCASA LA VALIDACIÓN SERÁ EXTENSA. CUANDO HAY GRAN INFORMACIÓN SOBRE UNA METODOLOGÍA LOS ENSAYOS PARA VALIDAR SON RELATIVAMENTE SENCILLOS, SI LA EXPERIENCIA ES ESCASA LA VALIDACIÓN SERÁ EXTENSA.

Se deben declarar los CRITERIOS DE APTITUD PARA LOS FINES. VALIDACION PRIMARIA Validación: Confirmación, mediante el aporte de pruebas objetivas, de que se han cumplidos los requisitos para el uso pretendido o una aplicación específica. [ISO 9000: 2000] Antes de realizar la validación se deben especificar: Alcance. Se deben declarar los CRITERIOS DE APTITUD PARA LOS FINES.

MÉTODOS NO NORMALIZADOS: Cuando sea necesario utilizarlos deben ser validados adecuadamente antes del uso. Búsqueda de información sobre datos de validación previa. Deben incluir una especificación clara de los requisitos del cliente y del objeto del ensayo.

MÉTODOS DESARROLLADOS POR EL LABORATORIO: Debe ser : Una actividad planificada (PROCEDIMIENTO) Ser asignada a personal calificado Proveer los recursos necesarios. Los planes deben ser actualizados a medida que avanza el desarrollo y deben asegurar que la comunicación sea eficaz entre todo el personal involucrado. En este caso, el proceso de validación es mucho más arduo, ya que se debe demostrar que cada paso elegido responde a lo esperado.

Una identificación apropiada de los métodos de ensayo. b) El alcance.(intervalo de concentración del analito) c) La descripción del tipo de Ítem a ensayar. d) Los parámetros o las magnitudes; y los rangos a ser determinados. e) Los aparatos y equipos, incluidos los requisitos técnicos de funcionamiento. f) Los patrones de referencia y los materiales de referencia requeridos. g) Las condiciones ambientales requeridas y cualquier periodo de estabilización que sea necesario Para los métodos de ensayo nuevos es conveniente elaborar procedimientos antes de la realización de los ensayos los que deben contener, como mínimo, la información siguiente:

Para los métodos de ensayo nuevos es conveniente elaborar procedimientos antes de la realización de los ensayos los que deben contener, como mínimo, la información siguiente (cont): h) La descripción del procedimiento incluida la siguiente información: -diagrama de flujo -marcas para identificación durante la manipulación, el transporte, el almacenamiento y la preparación de los ítems. - las verificaciones a realizar antes de comenzar el trabajo - la verificación del correcto funcionamiento de equipos y, cuando corresponda, su calibración y ajuste antes de cada uso; - el método de registro de las observaciones y de los resultados; -las medidas de seguridad a ser observadas. i) Los criterios o requisitos para la aprobación o rechazo. j) Los datos a ser registrados y el método de análisis. k) La incertidumbre o el procedimiento para estimar la incertidumbre.

LOS MÉTODOS NORMALIZADOS EMPLEADOS FUERA DEL ALCANCE PREVISTO Métodos normalizados aplicados a matrices que no se especifiquen en el procedimiento normalizado. Ampliaciones y modificaciones de los métodos normalizados. Para demostrar que una versión modificada de un método cumple las mismas especificaciones que el método original, deben realizarse comparaciones utilizando replicados.

Sistemas de ensayo comerciales (kits) Los laboratorios deben conservar los datos sobre la validación de los sistemas de ensayo comerciales (kits) que utilicen. Estos datos pueden obtenerse de ejercicios de intercomparación o de datos sobre validación remitidos por los fabricantes y sujetos a la evaluación de una tercera parte (p. ej., AOAC). wwwaoac.org Si no se dispone de datos sobre validación o si éstos no son plenamente aplicables, el laboratorio será responsable de completar la validación del método.

VALIDACION SECUNDARIA (Verificación) Demostración por experimento que un método establecido funciona de acuerdo con las especificaciones en las manos del usuario. Verificación: Confirmación, mediante el aporte de pruebas objetivas, de que se han cumplido los requisitos establecidos. [ISO 9000:2000]

MÉTODOS NORMALIZADOS: Antes de analizar cualquier muestra, los laboratorios deberán verificar su capacidad para cumplir de forma satisfactoria todos los requisitos establecidos en dichos métodos. El laboratorio debe confirmar que puede operar correctamente los métodos normalizados antes de introducir los ensayos. Se debe mantener actualizadas las normas. Si el método normalizado cambia, se debe repetir la confirmación.

MÉTODOS NORMALIZADOS: Cuando sea necesario, la norma debe ser complementada con detalles adicionales para asegurar una aplicación coherente. Ejemplo: La metodología empleada para la leche UAT incluye una incubación previa siete días a 37º C y luego se realiza el ensayo según FIL-IDF 100B:1991. Esto debe ser especificado cuando se hace referencia a la metodología en el informe de ensayo. No es necesario anexar o volver a escribir bajo forma de procedimientos las normas u otras especificaciones reconocidas que tengan suficiente información para realizar los ensayos.

LA VALIDACIÓN DE LOS MÉTODOS DE ENSAYO DEBE: REFLEJAR LAS CONDICIONES REALES DE ENSAYO. (USANDO PREFERENTEMENTE MATRICES NATURALMENTE CONTAMINADAS). LA EXTENSIÓN DE LA VALIDACIÓN NECESARIA DEPENDERÁ DEL MÉTODO Y SU APLICACIÓN. LA DEBE REALIZAR PERSONAL CALIFICADO PARA ESA ACTIVIDAD. EN TODOS LOS CASOS UN PARÁMETRO PARA LA VALIDACIÓN DE ENSAYOS MICROBIOLÓGICOS ES LA DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO.

1ra opción: Muestras naturalmente contaminadas Uso de muestras naturalmente contaminadas y preparación de muestras artificialmente contaminadas en estudios de validación Anexo C prEN ISO 16140:1999 1ra opción: Muestras naturalmente contaminadas 2da opción: Contaminación por mezcla. 3ra opción: Muestras inoculadas (el nivel de microflora debe representar la contaminación de las muestras naturalmente contaminadas). 4ta opción: Materiales de referencia AOAC usa en su mayoría la 3era opción teniendo en cuenta la dificultad de obtener naturalmente contaminadas.

Validar métodos microbiológicos requiere: Comparar con un MÉTODO DE REFERENCIA. Usar cepas de referencia y cepas de referencia certificadas.(Material de referencia). LA EVALUACIÓN SISTEMÁTICA DE FACTORES. Ensayos Interlaboratorios. La estimación de la incertidumbre. hacer experiencias repetidas en diferentes días, con diferentes matrices.

Segunda FASE: Estudios o ensayos colaborativos El PROTOCOLO INCLUYE: Primera FASE: Estudios precolaborativos o validación interna (estudios comparativos): Defino la aplicabilidad (concierne al analito de interés y a las categorías de alimentos a las que se aplica el método). (TABLA: Clasificación de categorías de alimentos para estudios de validación Anexo A AOAC). Segunda FASE: Estudios o ensayos colaborativos Cuando la exigencia es de disponer de métodos validados plenamente, se considera habitualmente que la validación plena de un método de análisis comprende un examen de las características del método en un estudio del funcionamiento del método entre laboratorios .

Clasificación de tipos de muestras para estudios de validación Anexo B prEN ISO 16140:1999

Primera etapa de la validación Ensayos selectivos se usan cepas en estudios de ( VALIDACION INTERNA): INCLUSIVIDAD: diferentes microorganismos pertenecientes al grupo deben ser detectados por el método. EXCLUSIVIDAD: diferentes microorganismos que no pertenecen al grupo no deben ser detectados por el método. SENSIBILIDAD No aplica a los ensayos no selectivos Ejemplo Rto microorganismos totales. ESPECIFIDAD

Cepas para ensayos de selectividad: prEN ISO 16140:1999 ANEXO G Categorías de Grupos “Target”: Elección de microorganismos ¿qué cepas uso? a) Un grupo Ejemplo Coliformes, levaduras, bacterias acido-lácticas Aquellas que dan reacción típica en el método de referencia. b) De la Familia Ejemplo Enterobacteriaceae Incluir miembros representativos de todos los género pertenecientes a la familia c) Género Ejemplo Salmonella spp Incluir miembros representativos si es posible de todas las especies pertenecientes al género. d) Especie Ejemplo Listeria monocytogenes Rango de cepas pertenecientes a la especie e) Cepa Ejemplo Listeria monocytogenes 1a Rango de fuentes de esta cepa Ejemplo ISO 16140 paina 43 Listeria G4.

Cepas para ensayos de selectividad: prEN ISO 16140:1999 ANEXO G Categorías de Grupos “no Target” : Elección de microorganismos a) Un grupo no target Aquellas que dan reacción negativa (según microorganismo target) b) De la Familia Incluir cepas no pertenecientes a la familia. c) Género Incluir cepas no pertenecientes al género similar a la cepa target d) Especie Incluir cepas no pertenecientes a la especie, incluidas en el género e) Cepa Incluir cepas no target, incluidas en la especie. Ejemplo ISO 16140 paina 43 Listeria G4. Que den reacciones cruzadas.

Cepas para ensayos de selectividad: prEN ISO 16140:1999 ANEXO G

Validación método cualitativo Descripción detallada del método de ensayo. LÍMITE DE DETECCIÓN SENSIBILIDAD ESPECIFICIDAD DESVIACIÓN POSITIVA Y DESVIACIÓN NEGATIVA EFECTO MATRICIAL Exactitud relativa repetibilidad y reproducibilidad

Compara el método a validar con el método de referencia. Diseño de un estudio de validación método cualitativo : AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002) Estudios precolaborativos o validación interna (estudios comparativos). Compara el método a validar con el método de referencia. Los realiza sólo el laboratorio organizador. 1.AMPLITUD MATRICES: Número de matrices a ensayar: teniendo en cuenta Categorías de alimentos a validar, analizar 20 o más alimentos de cada categoría. Obtención de muestras artificialmente contaminadas: Inoculo una sola cepa (de interés) por matriz. Según proceso al que se somete al alimento uso: -microoganismo estressado Alimentos procesados- -microoganismo sin estress Alimentos no procesados- -microoganismo liofilizado-productos en polvo.

Estudios precolaborativos o validación interna (estudio comparativos). Diseño de un estudio de validación método cualitativo : AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002) Estudios precolaborativos o validación interna (estudio comparativos). NIVEL DE INOCULO: Nivel bajo (límite de detección) 1-5ufc/25g de muestra Nivel alto 10-50ufc/25g de muestra CONTROL: Para muestras artificialmente contaminadas. Cada tipo de alimento se divide en dos, uno para control negativo y otro para obtener distintos niveles inóculo. CUANTIFICACIÓN DE LOS NIVELES DE CONTAMINACIÓN POR NMP: el mismo día que se analizan las muestras. Número de ensayos por nivel de analito: 20

Diseño de un estudio de validación método cualitativo : AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002) Estudios precolaborativos o validación interna (cont). 2. ESTUDIOS DE INCLUSIVIDAD Y EXCLUSIVIDAD: pruebo sólo la cepa.(cultivo puro) Pruebo 50 o más cepa target y 30 no target (método a validar y método de referencia).

Diseño de un estudio de validación método cualitativo : AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002) Estudios o ensayos colaborativos: ¡IMPORTANTE! Los laboratorios participantes acuerdan y estudian minuciosamente el protocolo de ensayo. Número de laboratorios:10 laboratorios (con datos válidos) por tipo de alimento. Los laboratorios participantes no conocen los valores de las muestras.(Muestras a ciegas) Número de matrices a ensayar: teniendo en cuenta Categorías de alimentos a validar. Consulta a comité de estadísticos

Diseño de un estudio de validación método cualitativo : AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002) Estudios o ensayos colaborativos: PREPARACIÓN DE MUESTRAS: Cepas inoculadas: Uso un cultivo puro cepa target. b) Nivel bajo (límite de detección) 1-5ufc/25g de muestra Nivel alto 10-50ufc/25g de muestra CONTROL. (Para muestras artificialmente contaminadas) EL LABORATORIO QUE ORGANIZA DEBE ASEGURAR LA HOMOGENEIDAD DE LAS MUESTRAS. Consulta a comité de estadísticos

Diseño de un estudio de validación método cualitativo : AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002) Estudios o ensayos colaborativos: CUANTIFICACIÓN DE LOS NIVELES DE CONTAMINACIÓN POR NMP: el mismo día que se analizan las muestras.(el laboratorio organizador) Número de ensayos por nivel de analito por cada tipo de alimento: 6 Número de ensayos por CONTROL NEGATIVO por cada tipo de alimento: 6 Consulta a comité de estadísticos

TEST de Chi cuadrado.( para datos nominales) Diseño de un estudio de validación método cualitativo : AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002) ANALISIS DE LOS RESULTADOS: Aplicable a Estudios precolaborativos y ensayos colaborativos. ENSAYO PARA DETERMINAR DIFERENCIA SIGNIFICATIVA: La proporción de positivos confirmados del método evaluado no debe ser estadísticamente diferente a la proporción positiva confirmada por el método de referencia para cada tipo de alimento y cada nivel de inoculación TEST de Chi cuadrado.( para datos nominales) Consulta a comité de estadísticos

Diseño de un estudio de validación método cualitativo : AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002) ANALISIS DE LOS RESULTADOS (cont): Aplicable a: Estudios precolaborativos ensayos colaborativos. B) INDICADORES DE APTITUD: Sensibilidad Especificidad FALSOS POSITIVOS para cada tipo de alimento y FALSOS NEGATIVOS cada nivel. Consulta a comité de estadísticos

Validación método cuantitativo Descripción detallada del método de ensayo. LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN. REPETIBILIDAD Y REPRODUCIBILIDAD EXACTITUD Desviación positiva y desviación negativa sensibilidad especificidad

Diseño de un estudio de validación método cuantitativo : AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002) Estudios precolaborativos o validación interna (estudios comparativos). Comparación del método a validar con el método de referencia. Aplica lo visto anteriormente para métodos cualitativos. (tener en cuenta los estudios de inclusividad y exclusividad sólo para ensayos selectivos) NIVEL DE INOCULO de las matrices: se evalúan 3 niveles de concentración de microorganismo (bajo, medio y alto) que abarquen todo el intervalo a validar. Y un control sin inocular. Uso fundamentalmente muestras naturalmente contaminados para ensayos no selectivo (no realizo el control) Elijo los niveles teniendo en cuenta la especificación

Diseño de un estudio de validación método cuantitativo : AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002) Estudios precolaborativos o validación interna (estudios comparativos). ESTUDIOS DE INCLUSIVIDAD Y EXCLUSIVIDAD: pruebo sólo la cepa.(cultivo puro) Pruebo 30 o más cepa target y 20 no target.(método a validar y método de referencia) ESTUDIOS O ENSAYOS COLABORATIVOS Estimación de desviación aleatorias y sistemáticas del método. Número de laboratorios: 8 laboratorios (con datos válidos) por tipo de alimento.

Diseño de un estudio de validación método cuantitativo : AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002) ESTUDIOS O ENSAYOS COLABORATIVOS: Recuento de microorganismos específicos: inoculación del microorganismo específico. SOLO PARA ENSAYOS SELECTIVOS b) NIVEL DE INOCULO de las matrices: se evalúan 3 niveles de concentración de microorganismo (bajo, medio y alto) que abarquen todo el intervalo a validar. Y un control sin inocular. Uso fundamentalmente muestras naturalmente contaminados para ensayos no selectivo (no realizo el control) Para cada tipo de alimento se analizan por duplicado (dos porciones) el método a validar y el método de referencia.

Diseño de un estudio de validación método cuantitativo : AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002) ESTUDIOS O ENSAYOS COLABORATIVOS Se realizan test para eliminar los outliers. INDICADORES DE APTITUD: Análisis de varianza y t por tipo de alimento y nivel de inóculo. Sr, r, SR, R, RSDr y RSDR por tipo de alimento y nivel de inóculo. “RSD es la desviación estándar relativa. Es independiente del valor del analito”

INFORME DE VALIDACION El laboratorio debe registrar: RESULTADOS OBTENIDOS. Establecer el rango de validación (es la parte del intervalo de concentración de un método de análisis que ha sido validado). PROCEDIMIENTOS USADOS. Declaración que el método es apropiado para el fin previsto. Toda la información referida a la validación debe documentarse y archivarse.

Extensión de la validación La extensión de la validación necesaria dependerá del método y su aplicación. “La validación es siempre un equilibrio entre costos, riesgos y posibilidades técnicas.” Cada laboratorio establecerá los requisitos que debe cumplir el método, con objeto de demostrar que son adecuados para la finalidad establecida.

Verificar periódicamente que se cumplen los parámetros documentados, Incluso cuando se haya realizado la validación, el laboratorio tendrá que : Verificar periódicamente que se cumplen los parámetros documentados, utilizando, por ejemplo: muestras inoculadas o materiales de referencia incorporados a las matrices más representativas. Aseguramiento de la calidad de los resultados

¡GRACIAS POR SU ATENCION!