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Técnicas de Estudio a Nivel Molecular DNA RNA - Southern Blot -PCR - FISH - Secuenciación -Northern Blot -RT-PCR -Microarray.

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Presentación del tema: "Técnicas de Estudio a Nivel Molecular DNA RNA - Southern Blot -PCR - FISH - Secuenciación -Northern Blot -RT-PCR -Microarray."— Transcripción de la presentación:

1 Técnicas de Estudio a Nivel Molecular DNA RNA - Southern Blot -PCR - FISH - Secuenciación -Northern Blot -RT-PCR -Microarray

2 Técnicas mas utilizadas para el estudio de DNA

3 Enzimas de restricción (endonucleasas) De origen bacteriano. Reconocimiento y corte de secuencias especificas (palindromicas) de 4 a 6 pb Sistema de protección bacteriana. EnzymeSite EnzymeSite AluIAG'CT NotIGC'GGCCGC BamHIG'GATCC PstICTGCA'G BglIIA'GATCT PvuIICAG'CTG EcoRIG'AATTC SalIG'TCGAC HaeIIIGG'CC Sau3AI'GATC HhaIGCG'C SmaICCC'GGG HincIIGTY'RAC SpeIA'CTAGT HindIIIA'AGCTT TaqIT'CGA HinfIG'ANTC XbaIT'CTAGA HpaIIC'CGG XhoIC'TCGAG KpnIGGTAC'C XmaIC'CCGGG MboI'GATC

4 Formación de extremos cohesivos Formación de extremos romos BamHI5´--G GATCC--3´ 3´--CCTAG G--5´ ---G´ 3´ 5´ GATCC CCTAG 5´ 3´ G--- HaeIII---GG CC CC GG--- HincII---GTC GAC CAG CTG GG CC CC GG GTC GAC CAG CTG---

5

6 USOS Tecnología de DNA recombinante Inserción en plásmidos Creación de moléculas híbridas Mapas de restricción (caracterización de un gen) Análisis de mutaciones Creación de bibliotecas genómicas Preparación de la muestra para técnicas posteriores (por ej. Southern Blot)

7 Southern Blot

8 Dos muestras A y B de simple cadena Se blotearon sobre la membrana Se Incuba con la sonda marcada Solo la sonda complementaria se pega a la secuencia correspondiente Se revela por autoradiografía o por quimioluminiscencia.

9 Gel de agarosa 0.7% con 14 muestras corridas Tras la digestión con EcoRI. Placa radiográfica revelando las cepas positivas Para el gen de interés.

10

11 Polymerase Chain Reaction Desarrollada por Kary Mullis en 1983 en California y publicada por primera vez en Science en Amplificación de fragmentos específicos de hasta bp Ensayo de corta duración, de alta especificidad y reproducibilidad Pequeñas cantidades de DNA Se necesita conocer la secuencia o al menos la sec. flanqueante Saiki, R., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K., Horn, G., and Erlich, H. (1985). Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230: Ciclos de Temperatura Preparación de la mezcla Análisis de resultados

12 PCR Termocicladores modernos Máquina de PCR primitiva

13 Real Time PCR Técnica utilizada para monitorear el progreso de una reacción de PCR a medida que transcurre (tiempo real). Pueden detectarse y cuantificarse cantidades mínimas de producto de PCR (DNA, cDNA or RNA). Está basado en la detección de fluorescencia producida por una molécula reportera. Esto ocurre debido a la acumulación del producto de PCR en cada ciclo de amplificación. Estas moléculas fluorescentes pueden ser colorantes que se unen a la doble hebra de DNA (ej. SYBR® Green ) o secuencias específicas (ej. Molecular Beacons or TaqMan® Probes). No es necesario pos procesamiento de la muestra. Real time PCR es fácil de llevar a cabo, con alta sensibilidad y mayor especificidad También puede estudiarse expresión mediante el uso de RNA como molde

14

15 Secuenciación de DNA

16 Método de Sanger

17 FISH

18 Detección de translocaciones Estudios de cariotipo Cromosomas marcados con sondas teloméricas Y un colado!!!!! Hibridación in situ para localización de expresión en tejidos. a) embrión de pez b) nucleolo

19 Técnicas mas utilizadas para el estudio de RNA

20 RT-PCR

21 Northern Blot

22 Y LO MAS NUEVO!!!!.... LO QUE ESTÁ DE MODA.....

23 Microarray


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