REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA

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1 REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA
(PCR) PROCESO QUE PERMITE FABRICAR UN NÚMERO ILIMITADO DE COPIAS DE CUALQUIER GEN. A PARTIR DE UNA SOLA MOLÉCULA DE ADN, LA PCR PUEDE GENERAR MILLONES DE MOLÉCULAS IDÉNTICAS EN UNA TARDE. ES UNA REACCION SENCILLA QUE REQUIERE UN TUBO DE ENSAYO, REACTIVOS Y UNA FUENTE DE CALOR. LA MUESTRA DE ADN QUE SE QUIERE COPIAR NO TIENE QUE SER PURA, PUEDE PROCEDER DE UN TEJIDO, DE UN CABELLO, DE UNA GOTA DE SANGRE COAGULADA (CRIMEN), O DE UNA MOMIA. LAS TÉCNICAS USADAS HASTA EL MOMENTO: USO DE ENZIMAS DE RESTRICCIÓN, CLONACIÓN E HIBRIDIZACIÓN TIENEN EL INCONVENIENTE DE SER PROCESOS LARGOS, CAROS Y NO SIRVEN CUANDO EL ADN ESTÁ DESNATURALIZADO.

2 APLICACIONES DE LA PCR DIAGNÓSTICO PRENATAL : TÉCNICAS INVASIVAS O NO INVASIVAS CÉLULAS FETALES EN SANGRE MATERNA. MEDICINA FORENSE TERAPIA GÉNICA. BIOTECNOLOGÍA: PRODUCCION DE BIENES Y SERVICIOS USANDO SISTEMAS BIOLÓGICOS (PAN, CERVEZA, VINO) DIAGNÓSTICO MOLECULAR IDENTIFICACIÓN DE ANIMALES (RAZAS) Y PLANTAS (ESPECIES Y VARIEDADES). ANIMALES Y PLANTAS TRANSGÉNICOS. LUCHA CONTRA LA CONTAMINACIÓN AMBIENTAL (DEGRADACIÓN DE SUSTANCIAS TÓXICAS) CAMINO DE LA EVOLUCIÓN (JURASSIC PARK). CARACTERÍSTICAS: ESPECÍFICA, SENSIBLE Y RÁPIDA.

3 CUANTIFICACION DE LOS PRODUCTOS DE PCR:
AUTORRADIOGRAFÍA: CON INCORPORACIÓN DE NUCLEÓTIDOS MARCADOS (32P). TINCION CON BROMURO DE ETIDIO. TINCIÓN CON PLATA. DENSITOMETRÍA: SE GRAFICA LA RELACIÓN DE LOS VALORES DE ABSORBANCIA DE LOS PRINCIPALES PARES DE BANDAS VERSUS LAS CONCENTRACIONES DEL MATERIAL GENÉTICO DE REFERENCIA.

4 LA TÉCNICA SE BASA EN CICLOS DE 1 O 2 MINUTOS
CON TEMPERATURAS QUE VARIAN ENTRE LOS 98ºC- 90ºC Y 60ºC- 55ºC. EN CADA CICLO EL ADN SE DUPLICA. LOS CEBADORES CONSTAN DE 20 A 30 BASES DE LARGO. LA POLIMERASA SE OBTIENE PURIFICADA DE LA BACTERIA THERMUS AQUATICUS, ESTABLE A ALTAS TEMPERATURAS. AHORA SE SINTETIZA POR INGENIERÍA GENÉTICA.

5 Hay 7 componentes esenciales en el proceso standard de PCR
ADN polimerasa termoestable Oligonucleotidos iniciadores (“primers”) Desoxiribonucleótidos trifosfatados (dNTPs) Cationes divalentes Buffer (para mantener el pH) ADN molde (Templado)

6 El ciclo de PCR Desnaturalización °C por 45 segundos si G+C < 55% Temperatura de hibridización (Annealing) – debe ser calculada o determinada empiricamente para cada par de primers demasiado alta = poco o nada de producto demasiado baja = annealing no específico = productos incorrectos Extensión - a la temperatura óptima de la ADN polimerasa utilizada ej.: 72°C para Taq 1 min/kb de longitud, dado que la Taq polimeriza 2000 pb/min solo a partir del 3r ciclo son producidos ADN duplex de la longitud deseada, los cuales a partir de allí se tornan en el producto principal Número de ciclos - - algunos componentes se tornan limitantes después de 30 ciclos (si el número inicial = 105 moléculas) - se necesitan >25 ciclos para amplificar un gen de copia única a partir de ADN genómico de mamífero DNA

7 ADN molde (templado) Puede ser ssDNA o dsDNA (simple o doble cadena)
ADN circular y cerrado es levemente menos efectivo que el ADN lineal Usualmente se utilizan varios miles de copias, ej: 1 µg de humano, 10 ng de levadura, 1 ng de bacteriano o 1 pg de plasmídico Se puede amplificar a partir de una sola molécula de ADN molde, pero las condiciones deben estar muy optimizadas

8 Oligonucleótidos iniciadores (primers)
Se conoce su secuencia Es el factor mas importante para la eficiencia y la especificidad del proceso Deben estar presentes en exceso (1013 = 30 ciclos, 1 kb) Requieren de un cuidadoso diseño Reglas de diseño: (a) longitud = 18-25 (b) Contenido de G+C entre 40-60% (c) Evitar las secuencias repetidas (d) Valores de Tm de no mas de 5°C uno del otro

9 ADN polimerasas termoestables
Llevan a cabo la síntesis de ADN dependiente del templado. Estabilidad – Taq: 9 min at 97°C, Pwo >2 hr a 100°C Fidelidad – Taq: baja, Pfu: alta Algunas presentan actividad transferasa terminal en el extremo 3´, ej. Taq agrega una A al extremo 3´, especialmente si en el extremo hay una C. Pwo y Tli generan extremos romos Cantidad usada = 5 x 1012 moléculas (1.5 unidades) La mas comúnmente usada = Taq ADN polimerasa Taq Thermus aquaticus, Pwo Pyrococcus woesei, Pfu Pyrococcus furiosus, Tli Thermococcus littoralis

10 Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
PCR es básicamente una técnica de amplificación del DNA. Muchas moleculas DNA (molecula sencilla) PCR amplificación

11 Síntesis por DNA polimerasa
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G Primers cortos de DNA específicos hibridizan con la cadena que tiene que ser copiada

12 Síntesis por DNA polimerasa
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T

13 Síntesis por DNA polimerasa
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T A

14 Síntesis por DNA polimerasa
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T A C

15 Síntesis por DNA polimerasa
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T A C G

16 Síntesis por DNA polimerasa
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T A C G T

17 Síntesis por DNA polimerasa
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR Síntesis por DNA polimerasa -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T A C G T A

18 Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
Despues del primer periodo de sintesis de DNA, tenemos copiada una cadena de DNA Primer 1 Extensión de la cadena Cadena original de DNA ¿Cómo produce este proceso una AMPLIFICACIÓN?

19 Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (~100°C)

20 Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (~100°C)

21 Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (~100°C) Luego, usando un segundo primer, se copia la nueva cadena con la DNA polimerasa 2 1 Al mismo tiempo, la cadena original se copia nuevamente, dado que hay un exceso de Primer 1 Ahora tenemos dos copias de la molécula original

22 Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
Para controlar el proceso, necesitamos controlar la temperatura Fusión 95°C Hibridización 50-60ºC Extensión de La cadena 75ºC 2do Ciclo 95ºC ºC 75ºC Primer Ciclo Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias Múltiples ciclos darán un incremento exponencial en el número de copias

23 Evitar las secuencias repetidas
5’-NNNNNNNNNNNNNTATA-3’ 5’-NNNNNNNNTATA-3’ 3’-ATATNNNNNNNN-5’ 3´ repetido PCR 5´ 3´ 3´ 5´ 5´ 3´ 3´ 5´ Dímero de primer

24 Evitar las secuencias repetidas
5´-TATANNNNNNNNNNNNN-3´ 5´-TATANNNNNNNN-3´ 3´-NNNNNNNNATAT-5´ 5´ repetido PCR 5´ 3´ 3´ 5´ 5´ 3´ 3´ 5´ no hay extensión

25 Evitar las secuencias repetidas
5’-NNNNNNNNNNNGCATGC-3’ 5’-NNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ 5’-NNNNNNNNNNNGCA 3’-CGT Formación de horquillas PCR 5´ 3´ 5´ 3´ 5´ 3´ Productos de PCR no deseados

26 Variantes de la PCR PCR standard Multiplex PCR Nested PCR (anidada)
PCR ASO PCR RFLP

27 Multiplex PCR Describe una PCR en la cual hay presentes múltiples pares de primers (hasta 8) lo que da una serie de productos. Los mismos pueden verse como múltiples bandas en un gel de agarosa PCR Multiplex es frecuentemente usada en diagnóstico médico Ahorra templado, tiempo y gastos Requiere una cuidadosa optimización

28 UNA VEZ QUE SE DEMOSTRÓ QUE LA PCR PUEDE SIMULTÁNEAMENTE AMPLIFICAR MÚLTIPLES LOCI EN EL GEN DE LA DISTROFINA HUMANA, SU USO SE HA GENERALIZADO. PERMITE AMPLIFICAR 13 O MÁS REGIONES SEPARADAS DE DNA. LOS PRIMERS DEBEN SER DISTRIBUIDOS DE FORMA TAL QUE ABARQUEN LA MÁXIMA EXTENSIÓN DEL GEN O SE CONCENTREN EN ZONAS CALIENTES (HOT SPOTS: DONDE SON MÁS FRECUENTES LAS MUTACIONES). DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LAS DISTROFIAS MUSCULARES.

29 Nested PCR A veces 1 ronda de PCR no da un producto único producto a partir de un templado complejo, apareciendo un “chorreado” Se puede resolver utilizando un segundo par de primers que hibriden un poco mas internamente que los primeros Realizar una segunda ronda de PCR usando el producto de la primera (chorreado) Rinde un producto único porque solo el fragmento correcto de ADN posee los sitios correctos de hibridización para el segundo par de primers

30 SUELE USARSE CUANDO HAY PROBLEMAS CON LA CANTIDAD Y CALIDAD DEL TEMPLADO A SER AMPLIFICADO. (MUESTRAS MUY DILUIDAS O POCO PURAS). LA MUESTRA ES PRIMERO AMPLIFICADA CICLOS, USANDO UN SET DE PRIMERS EXTERNOS. LUEGO UNA ALÍCUOTA MUY PEQUEÑA DE ESTA REACCIÓN ES AMPLIFICADA POR SEGUNDA VEZ DURANTE 15 A 25 CICLOS USANDO UN SET DE PRIMERS INTERNOS. ESTOS PRIMERS INTERNOS SE UBICAN DENTRO DEL DNA DE MODO TAL QUE LA SECUENCIA COMPLEMENTARIA PARA EL PAR DE PRIMERS INTERNOS ESTÁ PRESENTE EN EL PRODUCTO DE PCR OBTENIDO EN LA PRIMERA REACCIÓN DE AMPLIFICACIÓN Y ESTÁ DISPONIBLE PARA FORMAR EL COMPLEJO PRIMER- TEMPLADO.

31 Nested PCR 1era PCR Chorreado de ADN 2da PCR ADN específico

32 PCR ASO UTILIZA SONDAS ALELO ESPECÍFICAS. DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE FIBROSIS QUÍSTICA. PCR- SSCP ES UNA TÉCNICA SIMPLE Y PODEROSA PARA IDENTIFICAR CAMBIOS EN LA SECUENCIA DEL DNA AMPLIFICADO. SE BASA EN QUE LA MOVILIDAD DEL DNA EN UNA SOLA HEBRA EN GELES DE POLIACRILAMIDA NO DESNATURALIZANTES ES MUY SENSIBLE A LA SECUENCIA PRIMARIA, PROBABLEMENTE PORQUE LEVES CAMBIOS EN LA SECUENCIA PRODUCEN GRANDES EFECTOS EN LA CONFORMACIÓN. CUANDO SE HACE UNA PCR Y SE AMPLIFICAN FRAGMENTOS DE DNA DE 100 A 500 bp Y LUEGO SE HACE EL ANÁLISIS DE SSCP SE PUEDEN DETECTAR SUSTITUCIONES DE UN SOLO NUCLEÓTIDO CON ALTA SENSIBILIDAD. SE LLEVA A CABO UNA PCR STANDARD Y SE LE AGREGAN TRAZAS DE [32P]dCTP O PRIMERS MARCADOS.

33 RT-PCR = PCR con transcriptasa reversa
Para amplificar copias de cDNA de RNA Es especialmente útil cuando solo se dispone de pequeñas cantidades de RNA Frecuentemente usada para amplificar genes específicos (como cDNAs) si algo de su secuencia es conocida Requiere primer “antisense” y un DNA polimerasa dependiente de RNA Puede ser usada para construir bibliotecas de cDNA Primero se hace un cDNA a partir del templado de ARN Luego se usa un segundo primer (“sense”) para hacer el duplex de cDNA por PCR

34 PERMITE EL ANÁLISIS POR PCR DEL RNAm.
VENTAJAS: VERSÁTIL, SENSIBLE, RÁPIDO. USA RNATOTAL, Y ASÍ SE ELIMINA EL PASO DE PURIFICACIÓN DEL RNAm POLY (A) RT- PCR IN SITU: CORTES DE TEJIDOS.

35 RT-PCR mRNA (sense) Primer Antisense: oligo(dT)o Transcripción reversa
AAAAAAAAAA-3’ TTTTTTTTTT-5’ mRNA (sense) Primer Antisense: oligo(dT)o Transcripción reversa GSP1 (sense) GSP (antisense) AAAAAAAAAA-3’ TTTTTTTTTT-5’ 1ra cadena cDNA PCR usando GSP+GSP1 GSP1 GSP Requiere el conocimiento de la secuencia para diseñar GSP and GSP1

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37 PCR EN TIEMPO REAL AMPLIFICACIÓN ROBUSTA Y CONFIABLE (TAQ POLIMERASAS) ALTA ESPECIFICIDAD Y SENSIBILIDAD SE CUANTIFICA EL PRODUCTO DE PCR EN CADA CICLO HAY UNA ALTA CORRELACIÓN ENTRE LA SEÑAL Y LA CANTIDAD DE TARGET ALTA PRECISIÓN Y EXACTITUD. POSIBILIDAD DE PCR MULTIPLEX NO REQUIERE DE ANÁLISIS POSTERIOR A LA PCR (ELECTROFORESIS, ETC) SE PUEDE REALIZAR UN MAYOR NÚMERO DE REACCIONES POR DÍA. SISTEMA A TUBO CERRADO (CONTROL DE CONTAMINACIÓN) AMPLIO RANGO DE APLICACIÓN

38 DISEÑO DE PRIMERS Y SONDAS MÁS EXIGENTE
LOS PRODUCTOS DE AMPLIFICACIÓN SE OBSERVAN A MEDIDA QUE TRANSCURREN LOS CICLOS DE LA PCR SE BASA EN: LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE UN REPORTER FLUORESCENTE, CUYA SEÑAL AUMENTA EN PROPORCIÓN DIRECTA A LA CANTIDAD DE PRODUCTO DE PCR EN LA REACCIÓN. EL EMPLEO DE UN TERMOCICLADOR QUE TIENE ACOPLADO UN SISTEMA DE DETECCIÓN QUE ES CAPAZ DE ADQUIRIR Y CUANTIFICAR LA SEÑAL EMITIDA POR EL REPORTER AL FINAL DE CADA CICLO PARA CADA MUESTRA. LA QUÍMICA DE LA DETECCIÓN ESTA DADA POR: REACTIVOS FLOURESCENTES AGENTES INTERCALANTES FLOURESCENTES (SYBR GREEN)

39 Polimorfismos: Variaciones naturales producidas en un gen, secuencia de ADN, proteína o cromosoma que no tienen efectos adversos sobre el individuo y tienen lugar con una frecuencia bastante alta en la población general. Variación natural (polimórfica) de una secuencia de ADN entre los individuos. Se visualiza porque se suprimen o se crean nuevos sitios de restricción (corte) en el ADN, que cuando es digerido por una endonucleasa da lugar a fragmentos de ADN de diferente longitud. Polimorfismos de conformación de cadenas sencillas Técnica para el rastreo de mutaciones que identifica segmentos de ADN de cadena sencilla que muestran un patrón de migración anormal en la electroforesis en gel.

40 En biología molecular, el término polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción o RFLP (del inglés Restriction Fragment Length Polymorphism) se refiere a secuencias específicas de nucleótidos en el ADN que son reconocidas y cortadas por las enzimas de restricción (también llamadas endonucleasas de restricción) y que varían entre individuos. Las secuencias de restricción presentan usualmente patrones de distancia, longitud y disposición diferentes en el ADN de diferentes individuos de una población, por lo que se dice que la población es polimórfica para estos fragmentos de restricción. La técnica RFLP se usa como marcador molecular para identificar: grupos particulares de personas con riesgo a contraer ciertas enfermedades genéticas, en ciencia forense, en pruebas de paternidad y en otros campos, ya que puede mostrar la relación genética entre individuos.

41 El ADN de un individuo se extrae y se purifica.
El ADN purificado puede ser amplificado usando la PCR (Polymerase Chain Reaction), Luego es tratado con enzimas de restricción específicas para producir fragmentos de ADN de diferentes longitudes. Los fragmentos de restricción se separan mediante electroforesis en geles de agarosa. Esto proporciona un patrón de bandas que es único para un ADN en particular.

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46 Use of PCR in Forensic Science

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48 Un polimorfismo de un solo nucleótido o SNP (Single Nucleotide Polymorphism) es una variación en la secuencia de ADN que afecta a un solo nucleótido A, T, C o G del genoma. Por ejemplo, un SNP puede hacer que la secuencia AAGCCTA pase a ser AAGCTTA. Una de estas variaciones debe darse al menos en un 1% de la población para ser considerada como un SNP. Los SNP forman hasta el 90% de todas las variaciones genómicas humanas, y aparecen cada bases a lo largo del genoma humano. Dos tercios de los SNP corresponden a la sustitución de una citosina (C) por una timina (T). Estas variaciones en la secuencia del ADN pueden afectar a la respuesta de los individuos a enfermedades, bacterias, virus, productos químicos, fármacos, etc.

49 Los SNP son de gran utilidad para la investigación médica en el desarrollo de fármacos.
Debido a que los SNP no cambian mucho de una generación a otra, es sencillo seguir su evolución en estudios de poblaciones. También se utilizan en algunos tipos de pruebas genéticas. Los SNP se consideran una forma de mutación puntual que ha sido lo suficientemente exitosa evolutivamente para fijarse en una parte significativa de la población de una especie.