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Trabajo Práctico Nº 4: PCR en Tiempo Real Bqca. Mariana Ferramola 2011.

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1 Trabajo Práctico Nº 4: PCR en Tiempo Real Bqca. Mariana Ferramola 2011

2 ADN molde Primers Taq polimerasa dNTPs MgCl 2 Buffer Fluorocromo PCR en Tiempo Real: Componentes de la mezcla de reacción.

3 PCR en Tiempo Real vs. PCR convencional. PCR en Tiempo RealPCR convencional Amplificación y detección de productos en una misma etapa. Amplificación y detección de productos en 2 etapas separadas. Rango dinámico de detección amplio. Rango dinámico de detección estrecho. Detección durante la fase exponencial temprana (máxima eficiencia de reacción). Detección durante la fase exponencial. Mayor sensibilidad.Menor sensibilidad. Mayor especificidad con el uso de sondas. Menor especificidad. Requerimiento de equipamiento y reactivos muy costosos. Requerimiento de equipamiento y reactivos de bajo costo.

4 PCR en Tiempo Real vs. PCR convencional. PCR convencional. PCR en Tiempo Real.

5 PCR en Tiempo Real: ventajas. Sensibilidad Cuantificación Monitoreo de todo el procedimiento Disminución del riesgo de contaminación Automatización Amplicones pequeños Amplio rango dinámico Transcripción reversa

6 PCR en Tiempo Real: Fases de la curva de amplificación Donde: ΔRn es la intensidad de emisión de fluorescencia y se calcula como la diferencia en laemisión de fluorescencia normalizada (Rn) de la muestra y de un control sin templado (control negativo).

7 Etapas de la PCR en Tiempo Real. Los pasos de PCR y detección de productos son llevados a cabo por el equipo de PCR en Tiempo Real.

8 PCR en Tiempo Real: preparación de la muestra. PCR en Tiempo Real en un paso: La retrotranscripción y amplificación ocurren en el mismo tubo. Ventajas: se minimizan las variaciones experimentales y la posibilidad de contaminaciones. Desventajas: El ADNc generado sirve solo para una amplificación y se ha reportado que es menos sensible. PCR en Tiempo Real en dos pasos La retrotranscripción y amplificación ocurren separadamente. Ventajas: permite corroborar la eficiencia de la retrotranscripción y mayor sensibilidad. Desventajas: Mayor probabilidad de contaminación de la muestra.

9 PCR en Tiempo Real: instrumentación. Composición del equipo: Termociclador. Lector de fluorescencia. Recolector de datos. Conforman el mismo instrumento. Canales de lectura. Energía de excitación.

10 PCR en Tiempo Real: instrumentación. Tipos de emisores de energía disponibles: Lámparas (de halógeno o cuarzo). Diodos emisores de luz (LEDs). Láseres. La mayoría de los equipos presentan lectores de fluorescencia que permiten leer múltiples longitudes de onda simultáneamente. Esto posibilita el desarrollo de reacciones multiplex.

11 PCR en Tiempo Real: instrumentación.

12 PCR en Tiempo Real: consideraciones de amplificación. El buffer de reacción contiene: MgCl 2, KCl, dNTPs y Taq polimerasa. En caso de usarse un colorante de unión al ADN para cuatificación, este también viene incluído. En el caso del uso de sondas fluorescentes, estas se agregan a la mezcla de reacción por el operador La longitud óptima del amplicón es <100 pb. Sin embargo, se amplifican bien fragmentos de hasta 200 pb. La concentración de ADN inicial está entre ng. En el caso del uso de sondas, estas deben tener un Tm 10ºC mayor que el de los primers..

13 PCR en Tiempo Real: definición de ciclo umbral. En la fase exponencial temprana, la intensidad de fluorescencia alcanza un umbral que es significativamente mayor que la la fluorescencia de fondo. El ciclo en que esto ocurre se denomina Ct (threshold cycle).

14 Threshold Basal Control Negativo Ct ΔRn Muestra Rn Número de ciclos PCR en Tiempo Real: definición de ciclo umbral.

15 A mayor producto de amplificación mayor fluorescencia!!!! PCR en Tiempo Real: definición de ciclo umbral. El umbral de fluorescencia es un parámetro modificable. Este valor debe elegirse teniendo en cuenta que la reacción sea cuantificada en la fase exponencial temprana. Bajo condiciones ideales, se cumple que: log [ADNi] = 1/Ct

16 PCR en Tiempo Real: definición de ciclo umbral.

17 Rn: intensidad de la señal emitida por el reporter normalizada por la emisión del colorante utilizado como referencia pasiva (ROX) medido en el NTC. ΔRn: magnitud de fluorescencia generada durante la PCR. Threshold: umbral en el que se produce un cambio significativo en la fluorescencia. Basal: ciclos iniciales de la PCR (3-15) en los cuales hay cambios mínimos en la emisión de fluorescencia. Ct: número de ciclo en el cual la fluorescencia emitida supera el threshold. Está inversamente correlacionado con el log. del núm. inicial de copias. PCR en Tiempo Real: Expresión del nivel de fluorescencia.

18

19 Sist. de Detección Colorantes de unión al ADN Oligonucleótidos específicos Sondas fluorescentes Primers fluorescentes Sistemas de detección utilizados en la PCR en Tiempo Real.

20 Las tecnologías fluorescentes utilizadas incluyen: Colorantes de unión al ADN (SYBR Green). Sondas que fluorescen luego de su hidrólisis (sondas taqman). Sondas de hibridación. Sondas fluorescentes pegadas. Un fluoróforo es una molécula que absorbe radiación a una longitud de onda determinada y luego emite la energía absorbida en forma de luz a una longitud de onda diferente.

21 PCR en Tiempo Real: detección mediante SYBR Green. El SYBR Green es un colorante de unión al ADN, por lo que emite fluorescencia cuando se intercala en la doble hélice del mismo. Con los sucesivos ciclos, se va acumulando producto de reacción, en el cual se intercala el colorante, aumentando la fluorescencia emitida en cada ciclo.

22 PCR en Tiempo Real: detección mediante SYBR Green. VentajasDesventajas El mismo colorante puede usarse para diferentes blancos de amplificación. La presencia de dímeros de primers y amplificaciones inespecíficas generan falsos positivos. Relativamente económico.No agrega especificidad a la reacción. Necesidad de realizar una curva de disociación. Fácil optimización de las condiciones de reacción. No permite realizar PCR multiplex.

23 PCR en Tiempo Real: realización de curvas de disociación. Representa la medición de la/s temperatura/s de fusión de el/los producto/s amplificado/s Contenido de GC. Tamaño del amplicón.

24 PCR en Tiempo Real: realización de curvas de disociación.

25 PCR en Tiempo Real: detección mediante sondas de hidrólisis. Se lleva a cabo mediante la hibridación con una sonda complementaria a una región interna de la secuencia blanco, previamente a la amplificación. Tm sonda debe ser 10ºC > que el de los cebadores, de modo que hibride antes que los mismos.

26 PCR en Tiempo Real: detección mediante sondas de hidrólisis. A través del fenómeno de transferencia de energía fluorescente mediante resonancia (FRET), el fluoróforo quencher absorbe la energía fluorescente emitida por el fluoróforo reporter, cuando ambos están muy próximos entre si. La degradación de la sonda elimina este fenómeno, con lo que puede medirse la emisión del reporter.

27 PCR en Tiempo Real: detección mediante sondas de hidrólisis. VentajasDesventajas Incrementa la especificidad de la reacción. Debe diseñarse una sonda diferente para cada blanco a estudiar. Permite la realización de PCR multiplex. Relativamente más costoso. Permite realizar discriminación alélica mediante el uso de sondas ASO

28 PCR en Tiempo Real: detección mediante sondas de hibridación. Uso de 4 oligonucleótidos. El método utiliza dos primers (F y R) y dos sondas marcadas con fluorocromos, las cuales hibridan adyacentemente. Dador Aceptor

29 PCR en Tiempo Real: detección mediante sondas de hibridación. La sonda que hibrida corriente arriba tiene un fluoróforo dador en 3, y la sonda que hibrida corriente abajo tiene un fluoróforo aceptor en 5. El espectro de absorción del último se solapa con el espectro de emisión del primero. Esto resulta en emisión de fluorescencia por el fluoróforo aceptor, cuando ambas sondas están juntas. La transferencia de energía también se da mediante fenómeno FRET. La sonda que hibrida corriente abajo debe tener bloqueado su extremo 3, para no poder ser amplificada por la polimerasa. En la reacción que usa 3 oligonucleótidos el fundamento es el mismo, pero la sonda que se une corriente arriba es reemplazada por un primer marcado con el fluorocrómo dador.

30 PCR en Tiempo Real: detección mediante sondas de hibridación. VentajasDesventajas Incrementa la especificidad de la reacción. Debe diseñarse una sonda diferente para cada blanco a estudiar. Permite la realización de PCR multiplex. Relativamente más costoso. Permite realizar discriminación alélica mediante el uso de sondas ASO

31 PCR en Tiempo Real: detección mediante sondas fluorescentes plegadas (hairpin probes) Balizas moleculares Región secuencia específica Repeticiones invertidas Fluoróforo reporteroFluoróforo quencher

32 PCR en Tiempo Real: detección mediante sondas fluorescentes plegadas (hairpin probes)

33 VentajasDesventajas Incrementa la especificidad de la reacción, aun más que las demás sondas. Debe diseñarse una sonda diferente para cada blanco a estudiar. Permite la realización de PCR multiplex. Relativamente más costoso. Permite realizar discriminación alélica mediante el uso de sondas ASO

34 PCR en Tiempo Real: Tipos de cuantificación Tipos de cuantificación Absoluta: Necesita del uso de patrones, que deben ser incluidos en cada PCR realizada. Relativa: Da idea de los cambios generados en el nivel de un gen de interés, en comparación con un gen control que no varía con el tratamiento realizado. Sin importar que método de cuantificación se utilice, es importante que la eficiencia de la reacción de amplificación sea cercana a 100%.

35 PCR en Tiempo Real: cálculo de la eficiencia de reacción. Se realiza a partir de los datos recolectados de una curva estándar, aplicándose la siguiente fórmula: Eficiencia = [10 (-1/pendiente) ] – 1 Realizar diluciones seriada de una muestra o patrones. Se grafica Ct vs log de la concentración inicial de templado (o vs concentración de DNA en la muestra) Si la eficiencia de reacción fue del 100%, se obtendrá una recta cuya pendiente es de-3,32

36 PCR en Tiempo Real: cuantificación absoluta. Utiliza diluciones seriadas de estándares de concentraciones conocidas para construir una curva estándar. A partir de la curva se establece una relación lineal entre el Ct y la cantidad inicial de templado de ADN. La cuantificación absoluta asume que todos los estándares y las muestras tienen la misma eficiencia de amplificación.

37 PCR en Tiempo Real: cuantificación absoluta. Eficiencia cercana al 100%.

38 PCR en Tiempo Real: cuantificación relativa. Mide cambios en el nivel de un gen de interés, en relación al nivel de un gen control que no varía con las condiciones ensayadas. Se puede llevar a cabo a través de dos métodos. Método de la comparación de Ct. Método de la curva estándar para cuantificación relativa.

39 PCR en Tiempo Real: cuantificación relativa por el método de la comparación de Ct (2 -ΔΔCt ). Es el método más comúnmente utilizado. Se basa en un modelo matemático que calcula cambios en la expresión génica como diferencias relativas entre la muestra experimental y un calibrador (controles en los que hay expresión segura de los genes). ΔCt T= CtGi T – CtGe T ΔCt Calibrador= CtGi Co – CtGe Co ΔΔCt T= ΔCt T – ΔCt Calibrador ΔΔCt= 2 2 -ΔΔCt = 0,25

40 PCR en Tiempo Real: cuantificación relativa por el método de la comparación de Ct (2 -ΔΔCt ). El método de comparación de Ct permite una cuantificación relativa: la muestra tratada es x veces a la muestra del control.

41 PCR en Tiempo Real: Normalización. Los resultados de la PCR en Tiempo Real son normalizados frente a genes controles, que pueden servir a la vez cómo controles positivos. Se asume que la expresión de un gen endógeno es: Similar en todas las muestras, en un estudio dado. Resistente a variaciones experimentales. Conducida en todos los pasos de PCR con la misma cinética que el gen de interés. Para cada experimento debe seleccionarse un gen control cuya expresión no varíe en las condiciones experimentales a ensayar.

42 Ejemplos de genes usados como controles endógenos: β-Actina rARN 18S GAPDH β2-microglobulina PCR en Tiempo Real: Normalización.

43 Ej. Cuantificación Relativa (SYBR Green) mediante el método del 2 -(ΔΔCt) Objetivo : medir la expresión de TRalfa en leucocitos PMN de ratas controles e hipotiroideas. Endógeno: beta-actina. Tejido calibrador: hígado de rata.

44 Curva de Rango Dinámico TRalfa

45 Curva de Rango Dinámico Beta Actina

46 Cuantificación relativa de TRalfa mediante el método del 2 -(ΔΔCt). Se debe poner a punto: Concentración de primers. Concentración de cDNA. Se realizan 2 master mix: Target: TRalfa (muestra y calibrador). Endógeno: βactina (muestra y calibrador). No se debe olvidar en los cálculos los NTC.

47 Cuantificación relativa de TRalfa mediante el método del 2 -(ΔΔCt).

48 Cuantificación relativa de Tralfa: curvas de amplificación.

49 Cuantificación relativa de TRalfa : Curvas de amplificación.

50 Cuantificación relativa de Tralfa: Curva de disociación.

51 Cuantificación relativa de TRalfa mediante el método del 2 -(ΔΔCt) : expresión de resultados.

52 Objetivo: determinar genotipo homocigota o heterocigota para un determinado polimorfismo en gen de PPARγ2. Alelos: Ala12 Pro12 Ej. Discriminación Alélica mediante uso de sondas Taqman.

53 Sonda 1 (FAM) Sonda 2 (VIC) Alelo 1 Match Mismatch Alelo 2 Match Mismatch

54 Homocigota alelo 1: Heterocigota: Homocigota alelo 2:

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