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TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR Dra. Mariana L. Ferramola Curso de Técnicas moleculares aplicadas a bioquímica clínica. Área de Qca. Biológica FQByF,

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1 TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR Dra. Mariana L. Ferramola Curso de Técnicas moleculares aplicadas a bioquímica clínica. Área de Qca. Biológica FQByF, UNSL 2013

2 REACCIÓN DE PCR Esta reacción permite obtener un gran número de copias de una secuencia de ácido nucleico determinada, ya sea ADN o ARN.

3 RT-PCR Muestra de partida: ARN. Pasos de reacción: 1)Transcripción reversa para obtención de ADNc. 2)Amplificación de la secuencia deseada mediante PCR.

4 RT-PCR: Detección de virus de Influenza A. Pachucki y col., JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, June 2004, p. 2796–2798. Muestra: Hisopado nasal y faríngeo. Transcripción Reversa: RNA total, usando random primer hexamers. Identificación del virus de Influenza A mediante amplificación por PCR del gen de matriz de dicho virus (212bp).

5 RFLP-PCR Esta técnica aprovecha la aparición o eliminación de un sitio de corte para enzima de restricción debido a una mutación puntual. La técnica consta de dos pasos sucesivos: 1)Amplificación de la secuencia de interés mediante PCR. 2)Restricción de la secuencia amplificada con una enzima específica.

6 RFLP-PCR: Acción de las enzimas de restricción.

7 RFLP-PCR

8 RFLP-PCR: Detección de alelo Duarte (mutación N 314 D). La variante Duarte, es un alelo polimorfico del gen GALT, que da como resultado que la enzima presente actividad disminuída. La variante se debe a la mutación N 314 D, en la cual hay una sustitución (c.940 A˃G), que genera un cambio del aminoácido asparagina (Asn, N) por un ácido aspártico (Asp, D). Este polimorfismo genera un cambio de bases que determina un sitio de corte para la enzima de restricción AvaII.

9 RFLP-PCR: Detección de alelo Duarte (mutación N 314 D).

10 Análisis de la mutación N314D en el exón 10 del gen GALT humano. Línea 4: homocigota para el alelo mutado; líneas 1, 2, 5 y 6: heterocigotas y líneas 3 y 7 al 10: homocigotas para el alelo normal

11 RFLP-PCR: Detección de virus de Influenza A resistentes a Amantadina. Pachucki y col., JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, June 2004, p. 2796–2798. Primeramente se realiza una amplificación del gen de la proteína M2. Luego se detectan mutaciones puntuales que dan resistencia a amantadina, mediante el uso de enzimas de restricción.

12 GAP-PCR. Puede usarse un único par de primers que flanqueen la zona deleccionada, de modo tal que esta sea amplificada en la reacción de PCR. Para delecciones pequeñas (menores de 1Kb) el par de primers utilizados generará dos productos de amplificación, el fragmento de menor tamaño se producirá a partir del alelo que presenta la delección. Cuando la delección es mayor, la distancia entre los primers en el alelo normal es demasiado grande como para ser amplificada, y sólo se obtendrá producto a partir del alelo que presenta la delección (alelo mutado). En estos casos, el alelo normal es detectado usando un tercer primer, cuya zona de hibridación se encuentre dentro de la región que se encuentra delecionada en el alelo mutado Se utiliza para detectar delecciones en el ADN.

13 GAP-PCR: Detección de delecciones que causan α-talasemia..

14 Long range PCR. Esta técnica ha sido utilizada para detectar delecciones e inserciones. Pueden obtenerse amplicones de hasta 30Kb. El protocolo de PCR es modificado por la introducción de una polimerasa con actividad correctora de pruebas (3- 5-exonucleasa) además de la Taq polimerasa.

15 Long range PCR: Detección de inserciones

16 MAPH (múltiple hibridización de sondas amplificables) y MLPA (múltiple amplificación de sondas dependiente de ligación) Ambas son técnicas basadas en una amplificación cuantitativa por PCR. Presentan la ventaja de permitir el análisis de hasta 40 secuencia blanco simultáneamente. Son técnicas muy usadas para detección de delecciones y duplicaciones del genoma. Debido a la rapidez con que estas técnicas permiten escanear hasta 40 blancos, es muy probable que sean ampliamente usadas tanto para investigación como para diagnóstico. Por ejemplo para la caracterización/diferenciación de tumores.

17 MAPH: Síntesis de sondas Cada secuencia blanco es detectada por una sonda específica. Todas las sondas están flanqueadas por las mismas secuencias (en sus extremos 5 y 3), lo que permite amplificarlas todas con el mismo par de primers. Todas las sondas deben tener tamaños diferentes, para ser diferenciadas por el detector.

18 MAPH: Protocolo de ensayo.. Uno de los primers usados para la amplificación con PCR está marcado con un fluorocromo. Los productos de amplificación son separados por electroforesis capilar y detectados.

19 MLPA. Principales diferencias con el MAPH: Utiliza dos sondas para reconocer cada secuencia blanco. La hibridación de las sondas con el ADN blanco se realiza en solución. Luego de la hibridación de las sondas, se lleva a cabo una reacción de ligación.

20 MLPA: Protocolo de ensayo.. Las sondas hibridizan de manera inmediatament e adyacente, de esta manera solo aquellos pares de sondas que encuentran sus secuencias blanco pueden ser ligadas y amplificadas por PCR.

21 MLPA: Protocolo de ensayo.. Las sondas que reconocieron su secuencia blanco y pudieron ser ligadas son amplificadas por PCR, usando un único par de primers. Todos los amplicones generados deben tener diferente tamaño. Los productos obtenidos son separados por electroforesis capilar y detectados debido a su marcación fluorescente (usualmente en uno de los primers)

22 MAPH-MLPA: Resultados..

23 MAPH-MLPA: Resúmen..

24 SSCP (Polimorfismos de conformación de cadena única).. La técnica de SSCP detecta variaciones en la secuencia del ADN (mutaciones puntuales y otros cambios pequeños) debido a la generación de diferencias en la movilidad electroforética. Bajo condiciones no desnaturalizantes, las moléculas de ssADN asumen conformaciones únicas que dependen de su secuencia de nucleótidos. Los cambios conformacionales producidos por variaciones en la secuencia de ADN pueden resultar en diferencia de movilidad detectables. La mayoría de los experimentos de SSCP son diseñados para evaluar polimorfismos en un único locus, y comparar los resultados entre individuos diferentes.

25 SSCP 1.Un par de primers específico es utilizado para amplificar el AND blanco. 2.La muestra se enriquece en ssADN por medio de una PCR asimétrica, debido a la presencia de uno de los primers en mayor cantidad que el otro. 3.Las movilidades de los fragmentos simple cadena se comparan mediante electroforesis en un gel neutro de poliacrilamida. 4.Las bandas son detectadas.

26 SSCP: esquema de trabajo.

27 SSCP: ejemplo. El análisis del ADN por SSCP muestra haplotipos múltiples, o sets de alelos usualmente heredados como una unidad. Las calles 3 y 4 mostraron haplotipos idénticos de dos individuos diferentes. Las diferencias de migración de bandas en calles adyacentes está asociada co n la cantidad de nucleótidos diferentes presentes: calles 2-3 (2); calles 3-4 (0); calles 4-5 (3); calles 5-6 (1); calles 6-7 (3); calles 7-8 (1); calles 8-9 (1); y calles 9-10 (4).

28 Transferencia Southern Se utiliza para analizar fragmentos de DNA generados por digestión con enzimas de restricción.

29 Transferencia Southern

30 Principales usos: Detección de secuencias relacionadas ( ej. familias de genes). Detección de deleciones e inserciones grandes causantes de enfermedades (ej. Distrofia muscular de Duchenne). Identificación de individuos mediante VNTR. Detección de RFLP. Se utilizan sondas de gran tamaño, con grados de actividad variable, dependiendo del uso. Transferencia Southern


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