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Curso PCR 2007-08 Otras PCR: PCR en tiempo real (cuantitativa) Curso PCR 2007-08 Inma Martín Burriel.

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1 Curso PCR 2007-08 Otras PCR: PCR en tiempo real (cuantitativa) Curso PCR 2007-08 Inma Martín Burriel

2 Curso PCR 2007-08 Programa: Miércoles 23 de enero (11h): –PCR en Tiempo Real (teoría) –PCR en Tiempo Real (video) –Ventajas e inconvenientes de los distintos tipos de PCR-TR. Miércoles 23 de enero (15h): –Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real: Diagnóstico, expresión génica, análisis mutaciones.

3 Curso PCR 2007-08 Programa: Jueves 24 de enero (9:30h): –Protocolo experimental: Diseño de primers y sonda (Primer express). Validación de primers. Optimización de la reacción: –Matriz de primers –Matriz de sonda Curva standard. –Práctica

4 Curso PCR 2007-08 Programa: Miércoles 23 de enero (11h): –PCR en Tiempo Real (teoría) –PCR en Tiempo Real (video) –Ventajas e inconvenientes de los distintos tipos de PCR-TR. Miércoles 23 de enero (15h): –Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real: Diagnóstico, expresión génica, análisis mutaciones.

5 Curso PCR 2007-08 PCR clásico La cantidad de producto no está relacionada con la cantidad de DNA inicial Herramienta cualitativa (presencia o ausencia) El bromuro de etidio es poco sensible, cuando se detecta ya se ha sobrepasado la fase exponencial

6 Curso PCR 2007-08 Necesidad de PCR en tiempo real Necesidad de cuantificar diferencias de expresión de un mRNA Disponibilidad de muy pequeñas cantidades de mRNA en algunas prácticas laboratoriales: –Células obtenidas de microdisección por láser –Pequeñas cantidades de tejido –Biopsias embrionarias –Especimenes de gran valor

7 Curso PCR 2007-08 Técnicas de cuantificación Northern Blot

8 Curso PCR 2007-08 Early expression of p53 responsive genes (24h) Bax CD95/Fas GAPDH L C 6 8 10 12 M PCR Competitivo o PCR Mimic

9 Curso PCR 2007-08 Overexpression of antiapoptotic and carcinogenic related markers Bcl-2 Tgf-b1 c-myc L C 6 8 10 12 M PCR Competitivo o PCR Mimic

10 Curso PCR 2007-08 Martín-Burriel et al. Toxicologic Pathology, 32:202–211, 2004 PCR Competitivo o PCR Mimic

11 Curso PCR 2007-08 PCR en Tiempo Real Detección de productos PCR en tiempo real Permite observar la cinética de la reacción Nuevos químicos Nuevas plataformas instrumentales

12 Curso PCR 2007-08 Fases de la PCR Exponencial: En cada ciclo se dobla el producto. Lineal: enlentecimiento, consumo de componentes, principio de degradación. Meseta: Parada de la reacción, agotamiento de componentes, degradación de productos.

13 Curso PCR 2007-08 Fases de la PCR Lineal Logarítmica

14 Curso PCR 2007-08 Detección en la fase exponencial

15 Curso PCR 2007-08 Detección en la fase de meseta Problemas de cuantificación en la fase de meseta

16 Curso PCR 2007-08 PCR en Tiempo Real Toma los datos mientras se producen. Cuantificación más exacta sin necesidad de métodos laboriosos. Existe una relación cuantitativa entre la cantidad inicial y la cantidad de producto PCR en un ciclo dado.

17 Curso PCR 2007-08 Programa: Miércoles 23 de enero (11h): –PCR en Tiempo Real (teoría) –PCR en Tiempo Real (video)PCR en Tiempo Real (video) –Ventajas e inconvenientes de los distintos tipos de PCR-TR. Miércoles 23 de enero (15h): –Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real: Diagnóstico, expresión génica, análisis mutaciones.

18 Curso PCR 2007-08 Programa: Miércoles 23 de enero (11h): –PCR en Tiempo Real (teoría) –PCR en Tiempo Real (video) –Ventajas e inconvenientes de los distintos tipos de PCR-TR. Miércoles 23 de enero (15h): –Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real: Diagnóstico, expresión génica, análisis mutaciones.

19 Curso PCR 2007-08 Flurocromos: SYBR Green Se intercala en el surco menor del ADN de doble cadena y emite fluorescencia. No es equimolecular. Necesaria curva de disociación.

20 Curso PCR 2007-08 Ventajas e inconvenientes PCR con SYBR Green: –Más barato –Los mismos reactivos sirven para analizar cualquier fragmento –La especificidad viene dada únicamente por los primers –No es equimolecular –Se necesita realizar una curva de disociación

21 Curso PCR 2007-08 Curva de disociación

22 Curso PCR 2007-08 Curva de disociación

23 Curso PCR 2007-08 Curva de disociación Muestras problemaControles negativos y sin RT

24 Curso PCR 2007-08 Sondas TaqMan Actividad 5 exonucleasa de la Taq polimerasa. Reporter: FAM, VIC. Quencher: TAMRA. Importante tªm (~70ºC). Equimolecular.

25 Curso PCR 2007-08 Ventajas e inconvenientes PCR con Sondas TaqMan: –Más caro –Utilización de sondas específicas para cada fragmento a analizar –La especificidad viene dada por los primers y la sonda –Es equimolecular –No necesita curva de disociación

26 Curso PCR 2007-08 Especificidad Diseño de sondas entre dos exones

27 Curso PCR 2007-08 Equimolaridad TaqMan SYBR Green

28 Curso PCR 2007-08 Sondas MGB NFQ: Quencher oscuro, no emite fluorescencia. Disminuye Baseline. Aumenta sensibilidad. MGB: Se une al surco pequeño. Aumenta la Tªm. Aumenta la eficiencia. R NFQ MGB

29 Curso PCR 2007-08 CTG TGT TCC CTG TGT GTG TGC AAT GGT GTG GCC GTG GC TCC AAC CAA GAT CTC ATT ACT GAG AAC TTG CTG CCT GGC CGC Sonda 1 Metodología Reverse Forward ryr-1: Protocolo: Componentes de la reacciónVolumen / Reacción ( l) Final concentración TaqMan® Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG (2X) 12,51X 40X Assay Mix (Mescla de cebadores y sondas) 0,6251X DNA 21-20 ng H2OH2O 9,875--- Total 25 Pre-lectura: 60ºC 1min Post-lectura: 60ºC 1min PCR: 95ºC 10min 92ºC 15sec 60ºC 1min (x50) Sonda 2 FAM VIC

30 Curso PCR 2007-08 Resultados CC CT TT NTC

31 Curso PCR 2007-08 Programa: Miércoles 23 de enero (11h): –PCR en Tiempo Real (teoría) –PCR en Tiempo Real (video) –Ventajas e inconvenientes de los distintos tipos de PCR-TR. Miércoles 23 de enero (15h): –Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real: Diagnóstico, expresión génica, análisis mutaciones.

32 Curso PCR 2007-08 Aplicaciones de la PCR-TR Glosario de términos. Cuantificación: –Absoluta –Relativa Determinación de mutaciones. Ensayos +-

33 Curso PCR 2007-08 Aplicaciones de la PCR-TR Glosario de términos. Cuantificación: –Absoluta –Relativa Determinación de mutaciones. Ensayos +-

34 Curso PCR 2007-08 Cuantificación: –Absoluta: Resultado final con unidades (carga viral, copias de mensajero, copias de un gen,...). Se necesita una curva patrón absoluta. –Relativa: Resultado sin unidades. Proporciona un porcentaje de incremento o disminución (expresión génica). Se necesita curva patrón (al menos para prueba de primers). Glosario de términos

35 Curso PCR 2007-08 Glosario de términos Referencia: –Señal utilizada para normalizar el experimento. Pasiva: Fluorocromo en todos los tubos (ROX). Activa: endógena (housekeeping) o exógena (construcción). Calibrador: –Muestra que usamos para comparar las demás.

36 Curso PCR 2007-08 Standard (patrón): –Muestra de concentración conocida que nos permite construir la curva de calibrado. Threshold (umbral): –C t es el ciclo en el cual se detecta un incremento significativo de Rn (fluorescencia). El sistema empieza a detectar la señal asociada al incremento exponencial de producto PCR Glosario de términos

37 Curso PCR 2007-08 Aplicaciones de la PCR-TR Glosario de términos. Cuantificación: –Absoluta –Relativa Determinación de mutaciones. Ensayos +-

38 Curso PCR 2007-08 Curva estándar

39 Curso PCR 2007-08 Curva estándar

40 Curso PCR 2007-08 Curva Patrón y=ax+b. Y=Ct, X=log [DNA]. Relaciona cada concentración con su Ct. Propia de cada pareja de primers. La pendiente depende de la eficiencia de los primers y no debería cambiar entre experimentos: –100% (a=-3.32). –75% (a=-4). –Aceptable:-3 -4. –a> -3 contaminación por fluorescencia.

41 Curso PCR 2007-08 Correlación (R 2 ): –R 2 =1 (perfecta). –R 2 0.97. –Seleccionar el umbral donde R 2 sea máxima. –Mantener el umbral entre experimentos. Nº de réplicas: –Al menos 2 réplicas por muestra. –Desviación estándar 0.38 Muestra: –Curva absoluta: muestra de [] conocida. –Diluciones 1/5. Curva Patrón

42 Curso PCR 2007-08 1. Cuantificación Absoluta Validación de la curva patrón: –La precisión de la cuantificación dependerá de la precisión de los patrones. –Patrones: DNA plasmídico. DNA genómico. Productos PCR. Grandes oligonucleótidos comerciales. –Resultado final relativo a una unidad de interés: Copias/ng de RNA Copias/g tejido, copias/ml sangre. Copias/genoma. Copias/ célula. ATENCION DENOMINADOR

43 Curso PCR 2007-08 Posibles curvas de calibrado (Expresión génica): –Productos de RT-PCR u oligonucleótidos: Rápido, conocimiento preciso de [DNA]. Inestable, problemas en la reamplificación. –DNA recombinante: Muy estable, sin problemas de amplificación, talla similar a transcritos. Construcción del DNArec, no tiene en cuenta la eficacia de la RT. –RNA recombinante: Mimetiza la situación real de retrotranscripción (añadir RNA background). Muy inestable, clonación complicado, purificación, problemas de almacenamiento. 1. Cuantificación Absoluta

44 Curso PCR 2007-08 1. Cuantificación Absoluta Puntos críticos de la curva patrón: –DNA o RNA puro y muy concentrado. –Exactitud en la medida de la concentración inicial (7 veces). –Pipeteo apropiado: dilución del DNA o RNA original hasta concentraciones similares a las muestras biológicas (10 6 -10 12 ). –Estabilidad de las muestras patrón (RNA).

45 Curso PCR 2007-08 Curva patrón: –Sencillez en la preparación. –La cantidad de producto (n veces) se refiere a la obtenida en el calibrador (1x). –No hay unidades. –Se puede utilizar cualquier tipo de patrón para la obtención. 2. Cuantificación Relativa

46 Curso PCR 2007-08 2. Cuantificación Relativa Puntos críticos de la curva patrón: –Dilución adecuada del RNA o DNA patrón. –La utilización de las mismas muestras en placas distintas permite comparar resultados. –Se pueden utilizar patrones DNA para análisis de RNA. –Se necesitan curvas patrón para el gen de estudio y el control endógeno.

47 Curso PCR 2007-08 Ejemplo: cuantificación de SPP1 en cultivos celulares de células mesenquimales en diferenciaciónEjemplo: 2. Cuantificación Relativa

48 Curso PCR 2007-08 Aplicaciones de la PCR-TR Glosario de términos. Cuantificación: –Absoluta –Relativa Determinación de mutaciones. Ensayos +-

49 Curso PCR 2007-08 Polimorfismo de SNPs Sondas alelo-específicas. Utilización de sondas MGB/NFQ: Mayor discriminación. Utilización de oligos alelo-específicos y SYBR Green. Las curvas de disociación discriminan alelos.

50 Curso PCR 2007-08 Aplicaciones de la PCR-TR Glosario de términos. Cuantificación: –Absoluta –Relativa Determinación de mutaciones. Ensayos +/-

51 Curso PCR 2007-08 Ensayos +/- Se marca el ensayo con sonda TaqMan o SYBRGreen. Adición de un control interno positivo (control de amplificación). Eliminar Falsos Negativos

52 Curso PCR 2007-08 Programa: Jueves 24 de enero (9:30h): –Protocolo experimental: Diseño de primers y sonda (Primer express). Validación de primers. Optimización de la reacción: –Matriz de primers –Matriz de sonda Curva standard. –Práctica

53 Curso PCR 2007-08 Diseño primers Tamaño amplicon: 50-150pb %GC: 20-80% Máximo 2/5 G o C en el extremo 3 Longitud: 9-40pb (mejor 20pb, no se recomiendan longitudes <18pb)

54 Curso PCR 2007-08 Diseño de primers y sonda (Primer express).

55 Curso PCR 2007-08 Diseño de primers Tm: 58-60ºC –Tm: Tª en la que el 50% de las cadenas está unida y el 50% despegada –Si se pega más del 50% más posibilidad de inespecificidades –En tiempo real: Tª=Tm Diferencia de Tm entre los dos primers < 2ºC

56 Curso PCR 2007-08 Diseño de primers Primer F: Tm 58ºC Primer R: Tm 60ºC PCR: 60ºC [Primer F]

57 Curso PCR 2007-08 Matriz de Primers Primer Forward Primer Reverse 50nM300nM900nM 50nM2X 300nM2X 900nM2X

58 Curso PCR 2007-08 Matriz de primers Sensibilidad > Rn primers no limitantes

59 Curso PCR 2007-08 Diseño de sondas Tm sonda 10ºC > Tm primers Tm 70ºC la sonda se une inmediatamente antes de la mayor eficiencia de la polimerasa GC: 20-80% Longitud: 9-40b (si >30b sonda MGB) Nunca puede haber G en el extremo 5 (quencher natural) <4G continuas Procurar [C]>[G]

60 Curso PCR 2007-08 Matriz de sonda Se realiza tras la optimización de los primers (para ello sonda a 250nM) Utilizar distintas [sonda]: de 25nM a 225nM Componentes de la reacción Volumen / Reacción ( l) Final concentración TaqMan® Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG (2X) 12,51X Forward 1 900/300/50 nM Reverse 1 900/300/50 nM Sonda 1,25250 nM H2OH2O 8,25--- DNA 150 ng Total 25

61 Curso PCR 2007-08 250 nM 200 nM 150 nM 100 nM 50 nM Matriz de sonda Sensibilidad > Rn no limitante

62 Curso PCR 2007-08 Recta patrón Gen Referencia Nos muestra la eficiencia de los primers:

63 Curso PCR 2007-08 Recta Patrón: Gen de estudio

64 Curso PCR 2007-08

65 Referencia Activa Expresión génica: Muestra 1Muestra 2 Gen problema48 Control endógeno216 ratio20.5 Control de la eficiencia de la Retro-transcripción. Control de la eficiencia de la extracción de RNA. Buscar referencias bibliográficas. Utilizar tres endógenos.

66 Curso PCR 2007-08 Etapas del análisis de expresión Extracción de RNA Retrotranscripción Análisis de la expresión del gen (genes) de referencia Análisis de la expresión del gen de estudio Normalización Análisis de los resultados

67 Curso PCR 2007-08 Retrotranscripción El paso más delicado por la baja eficiencia de la enzima Distintas retrotranscriptasas en función del experimento: –Expresión génica (MLMv o modificaciones) –rTth DNA polimerasa (virus y fragmentos de RNA difíciles) Primers: –Random Hexamers expresión –Poly(dT) –Específico (la eficiencia de la RT dependerá del primer) virus

68 Curso PCR 2007-08 Análisis de expresión CON curva patrón Gen Referencia: GAPDH Gen Estudio: SPP1 T0 T7 27.36 -0.2 0.627 Cantidad relativa 27.68 -0.3 0.49 -0.42 0.38 Cantidad relativa -1.92 0.0121 16.62 21.58

69 Curso PCR 2007-08 Ejemplo: cuantificación de SPP1 en cultivos celulares de células mesenquimales en diferenciaciónEjemplo: 2. Cuantificación Relativa

70 Curso PCR 2007-08 Método de comparación de Ct Se basa en la eficiencia de los primers Se refiere a la muestra con mayor cantidad de gen de estudio (o menor Ct) Q = e (menor Ct- Ct muestra) e =10 -1/pendiente Si la eficiencia es del 100% e=10 -1/-3.32 =2 Análisis de expresión SIN curva patrón Ejemplo

71 Curso PCR 2007-08 Método de comparación de C t = 2- Ct Ct= C t, muestra - C t, calibrador C t, muestra : Valor de Ct para una muestra normalizado con el del control endógeno. C t, calibrador : Valor de Ct para el calibrador normalizado con el del control endógeno. = 2 - Ct Expresión gen/ Expresión basal del gen Expresión endógeno/ Expresión basal endóg Análisis de expresión SIN curva patrón

72 Curso PCR 2007-08 2. Cuantificación Relativa La eficiencia de la PCR puede enmascarar resultados.

73 Curso PCR 2007-08 2. Cuantificación Relativa PCR Múltiple: –Amplificación del gen de interés y el endógeno en el mismo tubo. –Reporter: 6-FAM y JOE. –Evitar competición en la reacción: Limitar la concentración de primers del gen más abundante.

74 Curso PCR 2007-08 Cuantificación Relativa Elección del método: –Estudio del gen de interés y del endógeno en tubos distintos y usar curva patrón: Rápida optimización y validación. –Utilización del método 2- Ct : Se necesitan eficiencias de amplificación similares. No necesita curva patrón. Elimina los errores de dilución de la curva patrón. –PCR Múltiple: Más puesta a punto. Mayor rapidez de análisis.


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